研究背景和目的肠上皮细胞是肠黏膜屏障和免疫稳态的重要调控者,肠屏障功能障碍和免疫反应失调是溃疡性结肠炎发病的两大关键因素。肠屏障功能破坏导致肠腔内病原菌接触黏膜下免疫细胞,诱发过度的免疫反应,导致肠道不可控的炎症。肠屏障功能的正常发挥依赖于肠上皮细胞间连接,尤其是紧密连接。除屏障功能外,肠上皮还具有免疫调控功能。在应对炎症因子或病原菌刺激时,肠上皮细胞能够分泌细胞因子和趋化因子介导肠道微生物和宿主免疫系统的反应,此过程主要由NF-κB信号通路调控。因此,肠上皮细胞在肠稳态中发挥重要作用,探寻调控肠上皮功能的分子将为肠稳态的维持及溃疡性结肠炎治疗提供新的方向。课题组前期发现 PBLD（Phenazine Biosynthesis-Like Domain-Containing Protein）在溃疡性结肠炎患者肠黏膜组织中表达显著下调,并且与患者临床病情严重程度呈负相关关系,提示PBLD可能在溃疡性结肠炎进展中发挥作用。PBLD是一个抑癌基因,能够抑制肝癌、乳腺癌和胃癌的发生发展。然而,PBLD在溃疡性结肠炎发病中的作用尚不明确。有研究报道胃癌细胞中过表达PBLD能够上调E-cadehrin表达,E-cadherin是细胞间连接分子,PBLD能否调控其他细胞连接分子表达（如紧密连接分子）进而影响肠屏障功能尚不明确。此外,研究表明PBLD通过抑制NF-κB信号通路抑制肝癌发生发展;溃疡性结肠炎患者中NF-κB信号通路显著活化,而抑制NF-κB信号通路能够缓解小鼠肠炎,但PBLD能否通过抑制NF-κB信号通路抑制溃疡性结肠炎发病尚不明确。因此,本研究聚焦于阐明PBLD在溃疡性结肠炎发病中的作用及其分子机制。研究方法和结果1.PBLD在溃疡性结肠炎患者病变组织中表达下降收集溃疡性结肠炎患者肠黏膜病变部位及非病变部位配对标本9例,检测PBLD、炎症相关分子和紧密连接分子表达。结果显示:PBLD在溃疡性结肠炎患者病变部位显著低表达;PBLD的表达与紧密连接分子表达呈正相关关系,与炎症因子表达呈负相关关系。予小鼠2.5%DSS饮用5天,正常水饮用3天以构建DSS诱导的小鼠肠炎模型,蛋白免疫印迹和IHC检测肠道组织PBLD表达,结果显示:PBLD在DSS诱导的小鼠肠炎中表达下调,PBLD主要表达于肠上皮细胞。2.肠上皮PBLD敲除加重DSS和TNBS诱导的小鼠肠炎通过CRISPR/Cas9系统构建肠上皮PBLD敲除小鼠（PBLDIEC-/-小鼠）和野生型小鼠（WT小鼠）,PBLDIEC-/-鼠大体与WT小鼠相似,正常状态下未见异常表型,肠上皮PBLD敲除不影响小鼠肠道结构和功能。予PBLDIEC-/-小鼠和WT小鼠2.5%DSS饮用5天,正常水饮用3天以制作急性肠炎模型。结果显示:与WT小鼠相比,PBLDIEC-/-小鼠体重下降更多,疾病活动度评分更高,肠道短缩更多,组织病理评分更高。予PBLDIEC-/-小鼠和WT小鼠DSS处理三个循环,每个循环DSS处理7天,随后饮用正常水14天以制作慢性肠炎模型。结果显示:与WT小鼠相比,PBLDIEC-/-小鼠体重下降更多,造模期间死亡率更高,肠道短缩更多,组织病理评分更高。予PBLDIEC-/-小鼠和WT小鼠TNBS灌肠以制作TNBS诱导急性肠炎模型。结果显示:与WT小鼠相比,PBLDIEC-/-小鼠体重下降更多,肠道短缩更多,组织病理评分更高。3.肠上皮PBLD敲除加重DSS诱导肠炎小鼠肠屏障功能障碍肠渗透性实验评估DSS诱导的肠炎小鼠肠屏障功能改变,结果显示:与WT肠炎小鼠相比,PBLDIEC-/-肠炎小鼠肠道渗透性显著升高。Western blot、RT-qPCR及免疫荧光技术检测肠炎小鼠肠道组织紧密连接分子表达,结果显示:与WT肠炎小鼠相比,PBLDIEC-/-肠炎小鼠肠道组织中ZO1和Occludin表达显著下调。此外,IHC检测肠炎小鼠肠道组织中杯状细胞数量和分布情况,结果显示:与WT肠炎小鼠相比,PBLDIEC-/-肠炎小鼠肠道组织PAS阳性及MUC2阳性细胞显著下调。4.PBLD过表达通过改善紧密连接分子表达增强Caco2细胞单层屏障功能慢病毒转染Caco2细胞构建空载（Caco2-Vector）和过表达PBLD的细胞株（Caco2-PBLD）,随后将细胞接种于transwell小室培养21天以使其汇合成细胞单层。通过测定细胞单层跨上皮电阻（TEER）和FITC-dextran渗漏实验评估细胞单层的屏障功能。结果显示:无TNFα/IFNγ刺激时,Caco2-PBLD细胞单层TEER变化与Caco2-Vector细胞单层无显著差异;有TNFα/IFNγ刺激时,Caco2-PBLD细胞单层TEER下降速度显著低于Caco2-Vector细胞单层。无论是否存在LPS刺激,与Caco2-Vector单层相比,透过Caco2-PBLD单层的FITC-dextran更少。Western blot 和 RT-qPCR 检测 Caco2-vector 和 Caco2-PBLD 细胞单层紧密连接分子表达,结果显示:与Caco2-Vector相比,Caco2-PBLD细胞单层中ZO1和 Occludin 表达显著上调。TNFα/IFNγ 处理 Caco2-vector 和 Caco2-PBLD 单层24h,免疫荧光和western blot检测紧密连接变化,结果显示:与Caco2-Vector单层相比,Caco2-PBLD单层能够抑制TNFα/IFNy诱导的紧密连接分子ZO1和Occludin表达下调,改善紧密连接分子细胞内定位。此外,Caco2单层过表达PBLD能够抑制TNFα/IFNγ诱导的NF-κB活化。5.肠上皮PBLD敲除增加肠炎小鼠肠道组织炎性细胞浸润及增强肠上皮细胞NF-κB通路活性IHC评估DSS诱导WT和PBLDIEC-/-肠炎小鼠肠道炎性细胞浸润情况,结果显示:F4/80和MPO阳性细胞在PBLDIEC-/-肠炎小鼠显著高于WT肠炎小鼠。流式细胞技术评估各组肠炎小鼠结肠黏膜固有层和肠系膜淋巴结炎性细胞浸润情况。结果显示:相对于WT肠炎小鼠,PBLDIEC-/-肠炎小鼠巨噬细胞、中性粒细胞和单核细胞在结肠黏膜固有层和肠系膜淋巴结显著升高。ELISA评估各组肠炎小鼠肠道组织炎症因子表达水平,结果显示:TNFα和IL-6表达水平在PBLDIEC-/-肠炎小鼠显著高于WT肠炎小鼠。提取DSS诱导WT和PBLDIEC-/-肠炎小鼠肠上皮细胞,Western blot评估肠炎小鼠肠上皮细胞NF-κB通路活化情况,结果显示:与WT小鼠相比,PBLDIEC-/-小鼠肠上皮提取物中NF-κB显著活化。RT-qPCR评估肠炎小鼠肠上皮细胞产生炎性因子和趋化因子情况。结果显示:与WT小鼠相比,PBLDIEC-/-小鼠肠上皮提取物中TNFα,IL-6,IFNγ,IL-1β,CCL20和IL-17c的表达显著上调。提取WT和PBLDIEC-/-小鼠肠上皮细胞,予TNFα刺激1h后行Western blot检测,结果显示:与WT小鼠相比,PBLDIEC-/-小鼠肠上皮细胞NF-κB活化显著增强。6.PBLD通过抑制NF-κB信号通路活化抑制肠上皮细胞炎症反应慢病毒转染FHC或HT29构建空载（FHC-vector或HT29-vector）和过表达PBLD 的细胞株（FHC-PBLD 或 HT29-PBLD）,TNFα 刺激这些细胞 1h,RT-qPCR检测过表达PBLD对肠上皮细胞炎症反应影响,相对于FHC-vector或HT29-vector,FHC-PBLD 或 HT29-PBLD 细胞中 TNFα,IL-1β,IL-6 和 IL-8 mRNA表达水平显著下调。Western blot和免疫荧光检测过表达PBLD对肠上皮细胞NF-κB活化的影响。在TNFα诱导下,相对于FHC-vector,FHC-PBLD细胞中pIκBα和pp65表达显著下调,p65从细胞质转位至细胞核减少。此外,双荧光素酶报告基因实验发现过表达PBLD能够显著降低FHC细胞中NF-κB活性。siRNA转染FHC构建空载（siNC）和PBLD敲低（siPBLD）的FHC细胞,NF-κB抑制剂（IKK16）预处理2h,随后用TNFα刺激1h。RT-qPCR检测PBLD敲低对肠上皮细胞炎症反应的影响。在TNFα刺激下,相对于siNC,siPBLD显著增加IL-1β,IL-6和IL-8 mRNA表达,而IKK16能够逆转siPBLD引起的变化。Western blot检测PBLD敲低对肠上皮细胞NF-κB活化的影响。在TNFα刺激下,相对于siNC,siPBLD增强NF-κB活化,而IKK16能逆转siPBLD引起的变化。在FHC-PBLD细胞中,免疫共沉淀发现PBLD能够与IKKα和IKKβ互作。结论1、PBLD在溃疡性结肠炎患者病变组织及DSS诱导肠炎小鼠中表达显著下调。2、在体内,肠上皮PBLD敲除加重溃疡性结肠炎模型小鼠肠道炎症,表现为肠屏障功能受损更严重,肠道组织免疫细胞浸润增加。3、在体外,PBLD通过改善肠上皮细胞紧密连接分子表达增强肠上皮细胞单层屏障功能。4、在体外,PBLD与IKKα和IKKβ互作抑制IKK复合物活性,从而抑制NF-κB活化,减轻肠上皮细胞炎症反应。