【摘 要】
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目的:研究TANK结合激酶1(（TANK-binding kinase 1,TBK1）在诱导Kupffer细胞（Kupffer cells,KCs）内毒素耐受中的作用。方法:建立内毒素耐受模型,即用小剂量（10 ng/ml）LPS刺激KCs 24 h后,再用大剂量（1000 ng/ml）LPS刺激。同时建立KCs非耐受模型,即KCs培养24 h后,直接用大剂量（1000 ng/ml）LPS刺激。收
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目的:研究TANK结合激酶1(（TANK-binding kinase 1,TBK1）在诱导Kupffer细胞（Kupffer cells,KCs）内毒素耐受中的作用。方法:建立内毒素耐受模型,即用小剂量（10 ng/ml）LPS刺激KCs 24 h后,再用大剂量（1000 ng/ml）LPS刺激。同时建立KCs非耐受模型,即KCs培养24 h后,直接用大剂量（1000 ng/ml）LPS刺激。收集上述细胞模型,进行以下检测:（1）western blotting检测TBK1、p-TBK1、c-Myb、DTX4、NF-κB和p-NF-κB蛋白水平;（2）RT-PCR测c-Myb、DTX4、TNF-α和IL-10的m RNA表达;（3）ELISA检测细胞上清TNF-α和IL-10的含量;（4）利用Ch Ip实验验证c-Myb对DTX4转录的影响;（5）激光共聚焦观察KCs内p-TBK1的分布情况。转染si RNA干扰TBK1表达后检测耐受组相关蛋白,m RNA表达情况。并利用缺陷慢病毒调控巨噬细胞中c-Myb表达,研究过表达以及沉默c-Myb后对DTX4,TBK1以及内毒素耐受的影响。建立小鼠内毒素耐受模型,观测小鼠的生存率并收集外周血和肝脏组织（1）HE染色观察小鼠肝脏组织炎症情况;（2）ELISA检测血清TNF-α和IL-10的含量;并检测小鼠血清AST,ALT水平,了解小鼠肝功能状况（3）免疫组织化学检测小鼠中磷酸化TBK1的表达情况。使用TBK1抑制剂MRT67307抑制TBK1表达后再检测上述指标。在小鼠体内通过慢病毒敲低c-Myb后建立内毒素耐受模型,通过HE染色观察小鼠的肝脏损伤程度,检测血清中TNF-α和IL-10的含量;并检测AST,ALT水平,了解小鼠肝功能状况。结果:建立体外细胞内毒素耐受、非耐受模型后,耐受组磷酸化TBK1水平明显高于非耐受组（ET:0.8505±0.05361 N=3,NET:0.5971±0.03383 N=3,P<0.05）,通过si RNA成功敲低TBK1后（Normal:0.9504±0.05772 N=3,si TBK1:0.3150±0.04815 N=3,P<0.05）,TBK1诱导内毒素耐受的作用减弱,耐受组TNF-α（ET:31705±567.5N=3,ET+si TBK1:37368±1163 N=3）,i NOS（ET:10733±752.4N=3,ET+si TBK1:15670±1096 N=3,P<0.05）表达增加;在建立小鼠经典内毒素耐受模型后,与体外模型结果一致,免疫组织化学检测结果显示耐受组小鼠肝脏TBK1磷酸化水平高于非耐受组。使用MRT67307（TBK1抑制剂）后,耐受组小鼠血清AST（ET:3.450±0.3072 N=3,ET+MRT67307:4.388±0.1182 N=3）,ALT（ET:1.582±0.2431 N=3,ET+MRT67307 5.097±0.8023 N=3,P<0.05）水平增加。在内毒素耐受模型中,NIK（ET:12867±295.5 N=3,NET:17784±1095N=3,P<0.05）表达水平降低,减少了P100加工,当TBK1水平降低后,NIK受到的抑制减少,磷酸化P100增加,TBK1诱导内毒素耐受与非经典的NF-κB信号通路相关。DTX4作为TBK1的负性调控因子,能够在内毒素耐受模型中促进TBK1的K48泛素化。通过Ch Ip实验证明转录因子c-Myb能转录调控DTX4,并且过表达c-Myb能降低DTX4转录,而沉默c-Myb能增加DTX4转录。通过过表达c-Myb能够增加TBK1表达,从而发挥内毒素耐受作用,使得TNF-α,i NOS表达减少。结论:TBK1能够诱导内毒素耐受,c-Myb通过负性调节DTX4,调控TBK1的K48泛素化起到调节Kupffer细胞内毒素耐受的作用。
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