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目的:水中尸体死因的鉴定一直是法医学领域的难点。生前入水与死后入水是水中尸体死因的两个类别。其中生前入水即溺死又可分为典型溺死与非典型溺死(干性溺死)两种。目前,溺死的法医学鉴定主要是在排除其他死因的基础上综合尸体征象与实验室检测作出判断,并无一个明确特异的金标准。典型溺死尸体征象明显,鉴定方法多样,但实际案例中检出率并不高。非典型溺死由于死亡机制特殊,时间过程短,所以尸体征象往往不明显,易与死后抛尸入水混淆。刑事案件中,区分生前入水与死后入水是明确案件性质的关键。在尸体征象不明显时,如有一种方法可以将典型溺死与干性溺死明确区分,排除易于混淆的一种,那么将有助于进一步区分生前入水与死后入水。由于非典型溺死与典型溺死死亡机制与过程并不相同,入水后发生的应激反应也不相同,进而参与调节应激反应的应激相关基因必然有所差异。本课题组建立了非典型性溺死与典型溺死两种大鼠模型,依照人类应激基因库选取了88种大鼠应激相关基因,在前期对管家基因稳定性研究的基础上选取了6种管家基因作为内参照基因,使用实时荧光定量PCR技术相对定量检测两种模型大鼠肺组织内88种应激相关基因的差异表达,希望能够发现一种或多种可以特异性区分两种死因的应激相关基因,作为鉴别非典型溺死与典型溺死的生物标志物。方法:1.研究对象:成年雄性SD大鼠8只,质量150g~220g,由山西医科大学动物实验中心提供。将8只大鼠随机分为两组,即非典型溺死组(实验组)与典型溺死组(对照组)。对照组大鼠投入水桶中至溺死捞出,实验组大鼠投入水桶中至大鼠鼻部第一次进入水中后将其捞出,迅速给予颈椎脱臼法处死(桶中水面高度约高于大鼠身长加尾长总和10 cm,并且水面高度约低于容器边缘至少10 cm;水为室温下放置2—3 d的自来水,水温10℃)。解剖大鼠,取其靠近右心室部位肺组织5g,放入装有1ml RNAlater的取样管中备用,-70℃低温冰箱保存。2.试验方法:组织提取RNA;RNA反转录为c DNA第一链;分别设计引物,通过实时荧光定量PCR检测8例大鼠肺组织中88种应激相关基因和6种常用的管家基因的Ct值。3.统计学处理:实验所得数据采用均数±标准差表示,使用SPSS13.0软件进行统计学分析,多样本均数比较采用方差分析,各组数据两两比较采用t检验。结果:1.本实验动物模型建立过程中,8只大鼠均在入水10~13min后鼻部第一次呛水,典型溺死组大鼠从鼻部第一次呛水至大鼠在水中溺亡,平均耗时大于5min。随后大鼠尸体解剖观测到,非典型溺死组大鼠肺组织无肉眼可见的水性肺气肿,切面无溺液流出,胃腔内无溺液存在,该模型为有效模型。2.6种管家基因中GAPDH基因在多个样本中未检测到,故在进行数据统计时排除。其余5种管家基因(B2M、HMBS、HORT1、OAZ1、ACTB)稳定性好,经两组组间差异性检验,P值均大于0.05。3.选取的88种应激相关基因在两组的表达均不相同。组间表达差异倍数较大(绝对值>2)的有25个,分别是HRH1、JUN、CCL2、HSPB7、HDAC5、HDAC6、CXCL2、HSPB2、EP300、CCR4、CXCL10、CCL7、CCL5、STAC、HDAC4、MAP2K7、CIDEB、IL9、IL13、IL5、IL1A、CD40LG、HSPB3、SCARA5、FOS;差异表达有统计学意义(P<0.1)的基因共有13个,分别是CCL2、CECPB、IL1A、IL13、CD40LG、MAPK1、IL1B、LIG1、CCL7、TAF1、DGKK、CXCL1、CCR2。表达差异倍数较大且有统计学意义的基因共有5种,分别是CCL2、CCL7、IL1A、IL13、CD40LG。4.将13种组间有显著性差异表达(P<0.1)的基因加入数据库进行GO term富集分析,结果显示,这13种基因的主要功能体现在四个层面:一是对细胞因子活性、免疫应答和损伤应答的调节,对应的基因为CXCL1,CCL2,CD40LG,CCR2,IL1B,IL1A,CCL7;二是对大分子合成的正向调节和大分子代谢过程的正向调节,对应的基因为MAPK1、TAF1、CEBPB、CD40LG、IL1B、IL1A;三是调控细胞增殖,对应的基因为CEBPB、CCL2、CD40LG、IL1B;四是对胞外空间的调节,对应的基因为CXCL1、CCL2、CD40LG、IL1B、IL1A、CCL7。结论:1.本实验所选内参照基因稳定性好,这与本课题前期实验结果相吻合。2.88种应激相关基因在两组的表达均不相同。其中,非典型溺死组与典型溺死组对比表达差异较大(绝对值>2)的基因有25种,两组对比差异表达有统计学意义(P<0.1)的基因共13种,这说明干性溺死与典型溺死两种死亡过程有不同的应激反应机制。3.以CCL2为代表的CCL家族基因和IL家族基因在典型溺死与非典型溺死两种类型死亡大鼠肺组织内的表达均有较大差异,是鉴别非典型溺死的有效生物标志物。4.研究结果提示我们,在接下来实验中应对CCL家族基因和IL家族基因进行深入的研究并扩大样本和应激基因库内其他应激基因的再筛选,最终推广到人类溺死尸体的法医学死因鉴定应用中。