【摘 要】
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酰基载体蛋白(ACP)在生命体的脂肪酸代谢合成中发挥着重要的作用,已被广泛研究和利用。该蛋白可在4’-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的作用下,使无活性的酰基载体蛋白(apo-ACP)形成
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酰基载体蛋白(ACP)在生命体的脂肪酸代谢合成中发挥着重要的作用,已被广泛研究和利用。该蛋白可在4’-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的作用下,使无活性的酰基载体蛋白(apo-ACP)形成有活性的酰基载体蛋白(holo-ACP),该修饰过程的检测操作复杂。本实验重组表达、纯化了来自枯草芽孢杆菌的4’-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(Sfp),优化了ACP特异性修饰的检测体系,同时对ACP与具有重要应用价值的青霉素G酰化酶(PGA)的重组表达进行了探索。holo-ACP具有的高活性巯基可高效介导蛋白质(酶)的定向、共价固定化,研究结果可为PGA的定向、共价固定化提供参考。本研究结果显示,ACP经Sfp修饰后,CoA分子的4’-磷酸泛酰巯基乙胺在Sfp的催化下可以高效转移到apo-ACP上,完成特异性修饰;利用Ellman法测定体系中CoA的含量变化,即可定量观测特异性的修饰过程;这一方法操作简便,且可为含有Sfp识别位点(短肽SRP)的融合蛋白的体外修饰提供技术支持。将ACP、Sfp的识别位点SRP分别与青霉素G酰化酶的α亚基、β亚基融合,并在大肠杆菌中重组表达,结果显示:可以纯化得到适宜浓度α和ACP-α,酶切得到ACP-β。青霉素G钾盐的催化水解结果表明,两种融合蛋白体外混合后,具有一定的催化活性。本实验初步建立了一种Sfp介导的特异性修饰检测体系,为蛋白质(酶)的定向、共价固定化研究提供了良好的技术支持。重组表达后的PGA活性值得进一步探究。
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