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背景:黑色素瘤起源于恶性黑色素细胞,恶性程度极高,死亡率高。发病率约占人体全身恶性肿瘤的2.0%,每年因为患此病而去世的人非常多。近十年的调查显示,恶性黑色素瘤的发病率呈连续上升的趋势。目前手术切除是临床上最常见的治疗手段,此外,也有很多黑色素瘤患者采用细胞免疫治疗,它的治疗效果相对更显著且持久。但是,大部分黑色素瘤患者对常规治疗会产生抗性,因此寻找治疗黑色素瘤更有效的方法迫在眉睫。结合肿瘤研究的现状发现,机体内存在着多种与黑色素瘤生长密切相关的基因,其中血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是近年作为研究的明星分子之一,被广泛当做肿瘤中的靶基因来研究,其主要功能是降解血红素使其释放胆绿素、CO和Fe2+。参与维持细胞稳态、降低机体的氧化损伤、减轻炎症反应以及调控细胞凋亡和细胞增殖等。已有文献证实,HO-1在肝癌、肺癌、乳腺癌等多种人体恶性肿瘤中呈现出高表达现象,HO-1在肿瘤中的异常表达会受到信号通路网络作用,进而调控细胞的增殖与凋亡。由于HO-1在黑色素瘤中的功能还鲜有报道,我试图采用CRISPR/Cas9技术进一步探究HO-1在黑色素瘤中的作用机制。CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术,其特点是能够定向改造和修饰基因,因此可以作为肿瘤的基因治疗的一种新策略和途径。我通过构建HO-1干扰、过表达和敲除载体,转染至人恶性黑色素瘤细胞A375中,探究HO-1的生物学效应及其调控的PI3K/AKT信号通路。目的:通过构建HO-1干扰、过表达和敲除载体,将其转染到A375细胞中,并建立稳定细胞系,检测A375细胞的增殖、凋亡及转移的变化。结合PI3K/AKT信号通路,探究敲除HO-1所产生的生物学效应的机制。研究方法:采用:测序检测A375细胞中的HO-1是否敲除成功,Western blotting检测HO-1及相关信号通路分子蛋白表达,Q-PCR检测信号通路相关的表达,细胞免疫荧光实验检测HO-1基因的表达分布,CCK8及克隆形成实验检测三种不同稳定细胞系的增殖能力,划痕实验检测三种不同稳定细胞系的迁移距离,流式细胞技术检测细胞的周期及凋亡情况,裸鼠成瘤实验检测HO-1对肿瘤生长的影响。结果:1.稳定细胞系鉴定结果Western blotting结果显示,与对照组相比,A375细胞中的HO-1过表达组其蛋白水平明显上升,HO-1干扰组蛋白水平降低,且细胞免疫荧光实验显示的荧光强度也得到了类似的结果。测序结果显示HO-1发生了移码突变且敲除成功。2.HO-1过表达有促进A375细胞增殖的作用,HO-1干扰对A375细胞增殖无明显影响,HO-1敲除显著降低A375细胞增殖CCK8结果表明,在96小时内HO-1过表达和干扰的细胞增殖能力与对照组相比无明显差异,HO-1敲除的稳定细胞系的细胞增殖与对照组细胞相比受到了明显的抑制。结晶紫染色结果显示,HO-1过表达细胞增殖数量跟对照组相比有一定的增加,HO-1干扰组细胞增殖数量较对照组无明显差异,但是HO-1敲除的稳定细胞系的细胞数量明显比对照组少很多。裸鼠成瘤实验结果一致显示,HO-1过表达有促进肿瘤生长的作用,HO-1干扰对A375细胞的增殖影响并不大,但HO-1敲除能显著抑制A375细胞的增殖。3.HO-1对A375细胞迁移没有影响细胞划痕实验结果显示,三种不同的稳定细胞系在12、24、36、48小时期间,同一时间段内的细胞迁移的距离均无明显差异,并且没有有效抑制A375细胞的迁移,说明HO-1对A375细胞的迁移能力影响不大。4.HO-1敲除显著抑制A375细胞增殖、诱导细胞凋亡流式细胞术的检测结果表明,过表达HO-1有促进A375细胞增殖,抑制细胞凋亡的作用,HO-1干扰对A375细胞的周期凋亡均影响不大,但是HO-1敲除能够显著促进A375细胞的凋亡以及S期细胞周期阻滞,说明敲除HO-1后抑制了细胞的增殖。5.HO-1敲除激活PI3K/AKT信号通路通过Western blotting和Q-PCR检测了PI3K、AKT、Bax、P21、等信号分子,结果显示HO-1敲除的稳定细胞系中PI3K、AKT等基因表达明显降低,Bax、Cyclin D1等基因表达显著上升,因此我推测HO-1主要是通过PI3K/AKT这条信号通路引起A375细胞发生周期阻滞,诱导细胞凋亡。结论:通过众多实验结果发现,过表达HO-1有促进A375细胞增殖并抑制其凋亡的作用,干扰HO-1不能有效抑制A375细胞的增殖和促进凋亡,但敲除HO-1能够显著抑制黑色素瘤细胞的增殖同时促进凋亡;其主要通过PI3K/AKT信号通路来调控。此外,未发现HO-1对A375细胞的迁移能力有影响。