桑葚是桑科植物桑的成熟果穗,因含有丰富的营养成分和化学活性物质,表现出多种药用价值,被同时收载于《中国药典》2015版第一部及药食同源原料目录(2017)。桑葚多糖是桑葚中高含量成分之一,部分研究已表明桑葚多糖具有抗氧化、免疫调节、降血糖等多种生物活性。此外,本课题组前期研究还发现桑葚多糖有良好的抗酒精性肝损伤作用,可能是一种治疗酒精性肝损伤的潜在物质。多糖属于一类天然高分子聚合物,分子量大,结构复杂,其结构直接或间接地影响自身生物活性的展现。然而,大多数多糖结构尚未明确,并且不同的分离纯化方法也可能获得不同质量不同类型的精制多糖,影响其生物活性、药效及构效关系的研究结果。因此为了更全面的认识桑葚多糖,深入了解不同桑葚多糖对酒精性肝损伤的影响,本文拟以乙醇分级醇沉方式获得桑葚多糖,展开桑葚多糖抗酒精性肝损伤作用的研究,为解酒保肝的医药和保健品领域提供物质基础,并促进桑葚多糖的开发和利用。但由于工作量大,硕士研究生阶段时间有限,本论文选择弱极性乙醇分级醇沉的桑葚多糖作为物质研究基础。本研究采用弱极性分级醇沉的方法初步纯化,再利用柱层析法进一步分离纯化获得精制桑葚多糖,从理化性质、分子量、单糖组成、结构特征,对精制桑葚多糖进行简单的结构表征;其次,运用不同化学修饰方法对精制桑葚多糖进行分子修饰,进而获得不同结构的桑葚多糖衍生物,为本研究提供物质基础。以获得的桑葚多糖及衍生物为研究对象,在体外建立乙醇脱氢酶活性(ADH)模型,以体外ADH活性的激活率为评价标准,筛选具有较好ADH活性的桑葚多糖;最后在此基础上,以筛选结果为对象,建立急性酒精性肝损伤动物模型,通过动物血清、肝脏生化指标和病理切片,系统评价桑葚多糖及其衍生物对急性酒精性肝损伤的保护作用。最终主要研究结果如下:(1)桑葚多糖的提取、分离纯化桑葚干品经粉碎、脱脂、热水浸提、70%和90%分级醇沉、脱蛋白、DEAE-52纤维素柱、Sephadex G-100凝胶柱层析分离纯化获得两种均一中性桑葚多糖(MFPs-70-1、MFPs-90-1)和两种均一酸性桑葚多糖(MFPs-70-2、MFPs-90-2)。(2)桑葚多糖的结构初步表征桑葚多糖的结构初步表征主要围绕其理化性质、分子量、单糖组成、结构特征进行。结果显示:4组分桑葚多糖的总糖含量、蛋白含量、糖醛酸含量、分子量及单糖组成均不一样。MFPs-70-1含总糖87.64%、蛋白质1.29%、糖醛酸6.26%、分子量为316 k Da,并由甘露糖11.0%、鼠李糖5.4%、半乳糖醛酸4.7%、葡萄糖33.5%和木糖45.5%组成;MFPs-90-1含总糖91.33%,蛋白质0.32%、糖醛酸5.53%,分子量为398 k Da,并由甘露糖7.2%、鼠李糖1.4%、葡萄糖28.6%和木糖62.8%组成;MFPs-70-2总糖60.27%、蛋白质1.06%、糖醛酸11.95%、分子量1584 k Da,并由甘露糖18.8%、鼠李糖4.6%、葡萄糖醛酸6.2%、半乳糖醛酸1.5%、葡萄糖34.7%、木糖25.5%和阿拉伯糖8.7%组成;MFPs-90-2含总糖71.41%、蛋白质0.56%、糖醛酸10.46%、分子量为229.1 k Da,并由甘露糖5.8%、鼠李糖15.4%、葡萄糖醛酸3.0%、半乳糖醛酸2.9%、葡萄糖36.5%、木糖21.2%、阿拉伯糖15.1%组成。并经红外光谱扫描发现:MFPs-70-1、MFPs-70-2、MFPs-90-1、MFPs-90-2可能均是含有吡喃环结构的桑葚多糖,此外MF Ps-70-2、MFPs-90-2可能还含有β-糖苷键。(3)桑葚多糖的分子修饰MFPs-70-1、MFPs-70-2、MFPs-90-1、MFPs-90-2经硫酸化修饰分别得到S-MFPs-70-1、S-MFPs-70-2、S-MFPs-90-1、S-MFPs-90-2,其取代度分别为0.33、0.58、0.55、0.40,得率分别为22.76%、27.93%、21.15%、23.05%。红外光谱扫描显示4组硫酸化衍生物均保留原多糖的结构,并且S-MFPs-70-1、S-MFPs-70-2、S-MFPs-90-1、S-MFPs-90-2分别在1146.32 cm-1、1149.62 cm-1、1147.21 cm-1、1143.27 cm-1出现强吸收峰,这是S=O结构的振动信号,说明桑葚多糖硫酸化修饰成功。MFPs-70-1、MFPs-90-1、MFPs-70-2、MFPs-90-2经羧甲基化修饰得到C-MFPs-70-1、C-MFPs-70-2、C-MFPs-90-1、C-MFPs-90-2,其取代度分别为0.49、0.52、0.41、0.33,得率分别为17.23%、30.68%、27.56%、28.33%。并经红外光谱扫描四组羧甲基化衍生物也保留着原多糖的结构;此外,C-MFPs-70-1、C-MFPs-90-1、C-MFPs-70-2、C-MFPs-90-2在1600~1400 cm-1附近的-COO-的信号增强,说明桑葚多糖羧甲基化成功。(4)体外ADH活性激活作用以桑葚多糖及其不同衍生物为研究对象,展开体外ADH活性的研究。探究桑葚多糖及其不同衍生物对ADH活性激活作用,确定未修饰组MFPs-70-1、MFPs-90-1、MFPs-70-2、MFPs-90-2及硫酸化衍生物组S-MFPs-70-1、S-MFPs-90-1、S-MFPs-70-2、S-MFPs-90-2均对乙醇脱氢有激活作用。并通过比较分析,MFPs-70-1、MFPs-90-1体外ADH活性相对较高(P<0.01);当桑葚多糖浓度为5 mg·m L-1时,MFPs-70-1、MFPs-90-1激活率分别为58.19%、58.47%。(5)体内急性酒精性肝损伤的保护作用基于ADH活性激活率结果,选择MFPs-70-1、MFPs-90-1及相应的硫酸化衍生物为研究对象,建立小鼠急性酒精性肝损伤动物模型。实验结果表明:每组桑葚多糖及其硫酸化衍生物(50 mg·kg-1·BW-1)均能控制小鼠体重降低,同时抑制血液中AST、ALT、TG指标水平和肝脏中MDA含量的显著升高(P<0.05)、肝脏中SOD、GSH-Px活力值显著增高(P<0.01),说明弱极性分级醇沉桑葚多糖(MFPs-70-1、MFPs-90-1)与其硫酸化衍生物(S-MFPs-70-1、S-MFPs-90-1)能提高小鼠机体的抗氧化能力,抑制脂质过氧化物生成,从而保护小鼠肝脏受损。其中S-MFPs-90-1组与模型组相比血清AST、ALT、TG指标水平和肝脏MDA含量均显著降低(P<0.05),分别降低17.15%、32.34%、21.29%、28.46%;同时SOD、GSH-Px活力值显著升高(P<0.01),分别增高44.40%、112.61%,表现出相对较突出的抗氧化作用。通过观察病理切片发现:模型组小鼠肝细胞严重破裂变形、细胞肿胀、细胞间隔增大、细胞核裸露;各给药组小鼠肝脏细胞破裂程度及细胞肿胀程度减轻、细胞间隔减小,肝细胞损伤得到不同程度的修复和改善。综合模型组血清和肝脏生理指标及病理切片可知:急性酒精性肝损伤动物模型成功建立;弱极性分级醇沉的桑葚多糖(MFPs-70-1、MFPs-90-1)及其硫酸化衍生物(S-MFPs-70-1、S-MFPs-90-1)均有抗急性酒精性肝损伤的作用,其中S-MFPs-90-1的效果可能相对较好。然而,这与在体外ADH激活作用的结果不同,原因可能与S-MFPs-90-1有良好的抗氧化能力及酒精在肝脏中发生复杂的代谢有关。综上所述,弱极性分级醇沉桑葚多糖(MFPs-70-1、MFPs-90-1)及其硫酸化衍生物(S-MFPs-70-1、S-MFPs-90-1)对酒精所致的小鼠急性肝损伤具有保护作用,可能是潜在的解酒保肝的物质。