CTLA4/CD80信号通路对免疫系统内稳态的维持尤其是T细胞介导的免疫内稳态至关重要。T细胞的活化需要两个信号的刺激。第一信号是由T细胞受体(TCR)与抗原递呈细胞(APC)上的组织相容性复合物MHC呈递的抗原肽特异性结合而启动。第二信号主要由T细胞表面的免疫共刺激因子CD28与APC上的配体B7-1(又名CD80)或B7-2(又名CD86)结合所引发的。两个信号共同作用,活化T细胞。CTLA4是T细胞表达的免疫抑制性受体,属于CD28家族,它可以与CD28竞争结合APC上的相同配体,但抑制T细胞的活化。当T细胞活化后,CTLA4在T细胞中表达并快速转运至免疫突触,产生免疫抑制信号。此外,由于CTLA4对B7配体的结合亲和力高于CD28,并与CD28竞争结合B7配体,抑制了共刺激信号,产生抑制IL-2作用和T细胞增殖的阴性信号。因此,CTLA4抵消CD28的活性,作为T细胞介导的免疫应答的共抑制分子,也称为免疫检查点。是免疫系统防止免疫过度激活的重要机制。癌细胞可通过激活免疫检查点信号来抑制肿瘤免疫、逃避免疫监视,从而能够在体内生长。因此阻断CTLA4与B7配体的相互作用可能会释放CTLA4对T细胞免疫反应的“制动”,从而导致肿瘤死亡。因此,CTLA4成为了第一个针对癌症治疗的靶向免疫检查点。近年来,CTLA4抗体和CTLA4融合蛋白的临床研究取得了重大突破。Ipilimumab是CTLA4的首批免疫治疗抗体,已于2011年被FDA批准用于治疗转移性黑色素瘤,现已成为治疗该疾病的标准治疗方法。相反地,CTLA4-Fc融合蛋白,一种B7拮抗剂,能够与B7配体结合并阻断T细胞活化所需的第二信号,从而成为自身免疫疾病的临床治疗药物。例如,重组CTLA4融合蛋白Abatacept,包含人CTLA4的胞外域结构和人IgG1 Fc片段,被批准作为用于类风湿性关节炎(RA)的选择性共刺激抑制剂。Belatacept也是CTLA4和Fc的融合蛋白,于2011年被FDA批准用于肾移植患者。目前,阻断CTLA4/B7信号途径的临床试剂主要是抗体或融合蛋白的大分子蛋白,而很少有小分子抑制剂被报道。抗体分子虽然具有很好的治疗效果,但其仍存在一些自身缺点,例如分子量大,结构复杂和二硫键依赖性,这导致抗体分子的热稳定性低,制备过程复杂且成本高,以及肿瘤渗透效率较差,这些缺点造成了抗体药物治疗的局限性。小分子抑制剂如今已成为一个有吸引力的研究领域。在一定的治疗效果下,小分子抑制剂可以降低免疫原性副作用,降低成本,提高穿透肿瘤的效率。单体抗体样支架分子(monobody或adnectin)在小分子抑制剂中脱颖而出。这类蛋白分子来源于人类Ⅲ型纤连蛋白的第10单元(以下称为FN3)。FN3是由94个氨基酸组成的单体,属于免疫球蛋白超家族。FN3的结构高度类似于抗体的可变结构域,它们都具有两组反向平行的β折叠夹层结构。FN3的三个环BC,DE和FG在结构和空间位置上类似于抗体中作为抗原结合位点的互补决定区(CDR)。同时,FN3的BC,DE,FG环可以被替换或突变而仍然保持结构稳定,并成为具有靶蛋白结合能力的蛋白,这类蛋白分子即被称为monobody 或 adnectin。monobody 保持了 FN3 的结构稳定性。一些针对 monobody的临床前研究正在开展。作为抗血管生成单体的CT-322 monobody在临床前研究和临床Ⅰ期试验中,通过抑制血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)信号传导显示出降低肿瘤生长和低毒性的潜在作用。此外,最近的一项研究报道,结合免疫检查点配体PD-L1的monobody单体可以与肿瘤细胞上的PD-L1结合,并且临床中正在用于在追踪人类肿瘤中无创性PD-L1表达的定量分析研究。方法:利用基因工程技术,讲CTLA4的CDR1和CDR3区架构到FN3对应的区域,即BC环和FG环,构建了 CFN13和CFN13-Fc的重组基因,转入大肠杆菌进行诱导和表达,利用Ni-NTA柱纯化这些重组蛋白,在本研究中,我们利用FN3生物骨架构建了 CTLA4小分子蛋白类似物CFN13和CFN13-Fc,通过酶联免疫吸附实验(ELISA)来评估这些蛋白的体外活性。为了选择CTLA4上的移植结构域,选取CTLA4的互补决定区(CDR)3上的CD80结合结构域(MYPPPY基序)并合成了小肽EL16。竞争性ELISA实验发现小肽EL16能够显著抑制CTLA4与CD80的相互作用。随后,我们利用基因工程技术将小肽EL16以及CTLA4的CDR1(这个区段对与CD80的结合也是关键的)移植到FN3上并获得新的CD80结合单体蛋白CFN13。CFN13显示出天然受体蛋白CTLA4 80%的结合亲和力。另外,为了增加半衰期,将CFN13与人IgG1 Fc融合,构建了CFN13-FC融合蛋白。如所预期的,CFN13-FC与CD80的结合方式类似于CFN13,都是以剂量依赖性方式与CD80结合,并且在浓度为200 μ g/ml和100 μ g/ml时,对天然受体CTLA4-Fc与CD80的相互作用分别显示出41.0%和31.4%的抑制。此外,肽EL16可显著性抑制CFN13-Fc与CD80的结合,在浓度为100 μ g/ml和50 μ g/ml时抑制率分别为64.3%和52.8%,表明小肽EL16与重组蛋白CFN13-Fc具有相似的CD80结合位点,且CTLA4的CDR3基序在与CD80的结合中比CDR1贡献更多。进一步地,我们通过SWISS-MODEL构建肽EL16和重组蛋白CFN13的3D结构。通过ZDOCK模拟EL16/CD80和CFN13/CD80的结合模式。计算机模拟的结果显示肽EL16和CFN13共有的“MYPPPY”基序与CD80的非极性表面形成疏水性接触,是对CD80的结合贡献最大的区段。综上所述,我们的研究为CTLA4小分子蛋白类似物的构建提供了有意义的新思路。