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目的:研究消癥化瘀法通过调控Wnt通路关键蛋白β-catenin和Cyclin D1影响肺癌干细胞(Lung Stem Cell,LSC)的增殖,探讨消癥化瘀法治疗肺癌的机制。方法:(1)人肺腺癌细胞系A549侧群细胞(Side Population细胞,简称SP细胞)的分选及其干细胞特征鉴定的研究:通过流式细胞荧光激活分选技术(Fluorescence-activated cell sorting,FACS)对人肺腺癌细胞系A549中SP细胞和非SP细胞进行分选,并通过体外克隆形成实验、MTT法观察细胞增殖、流式细胞仪分析细胞的周期及分化和裸鼠体内成瘤实验等方法,分析SP细胞亚群、非SP细胞亚群和总细胞的体内、外增殖能力、细胞分化能力以及体内成瘤能力。(2)消癥化瘀法通过调控Wnt通路关键蛋白β-catenin和Cyclin D1影响对肺癌干细胞的增殖的研究:培养人肺腺癌细胞系A549,采用流式细胞仪分选技术,筛选并鉴定其中具有干细胞特性的SP细胞,选用消癥化瘀法的代表方回生口服液,用回生口服液的含药血清进行干预,设置回生口服液高、中、低剂量组(11.6g/kg,5.8g/kg,2.9g/kg)及空白对照组,被干预后的各组肺癌干细胞进行裸鼠左腋皮下成瘤实验,成瘤后检测裸鼠瘤重与抑瘤率;采用Westernblot法检测各组肺癌干细胞中的关键蛋白β-catenin和Cyclin D1表达水平。结果:(1)FACS分选结果显示:人肺腺癌细胞系A549中含有约(1.79±0.12)%的SP细胞;体外克隆形成试验和MTT试验结果表明:SP细胞的体外增殖能力明显强于非SP细胞;流式细胞仪分析细胞周期示:SP细胞的G0/G1期所占比例明显高于非SP细胞(P<0.05);细胞分化实验结果显示:SP细胞和非SP细胞经过培养分选后,二者的SP细胞所占比例分别为(1.49±0.05)%和(0.16±0.04)%(P<0.05);裸鼠体内成瘤实验显示:SP细胞的成瘤能力明显强于非SP细胞。(2)相比于空白对照组,回生口服液高、中剂量组瘤重降低明显(P<0.01,P<0.05),其抑瘤率也明显升高(P<0.01);回生口服液高、中剂量组肺癌干细胞中关键蛋白β-catenin和Cyclin D1的表达都有明显下调趋势(P<0.01,P<0.05)。结论:人肺腺癌癌细胞系A549通过FACS分选出的SP细胞具有干细胞特征,SP细胞作为一种不通过寻找特异性的表面标记物而是利用其让荧光染料外排的特性来分离、富集的肿瘤干细胞,可以作为研究肿瘤干细胞的一种较理想和简便的途径。消癥化瘀法治疗肺癌的分子作用机制之一,可能与通过抑制肿瘤干细胞关键蛋白β-catenin和Cyclin D1的表达,阻止肺癌干细胞wnt信号转导通路异常激活,影响肺癌干细胞的增殖,从而抑制肺癌。