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第一部分γδT17细胞在哮喘小鼠气道炎症中的表达及意义目的观察γδT17细胞及细胞因子IL-17在哮喘小鼠气道炎症中的表达及意义,并探讨其可能的作用机制。方法采用随机数字表法将SPF级健康雄性Balb/c小鼠随机分为2组,即对照组和哮喘组,每组6只。采用鸡卵清蛋白(OVA)致敏、激发制备哮喘动物模型,对照组予以PBS代替OVA致敏、激发造模。两组小鼠在模型制作成功后12h内使用无创肺功能仪检测小鼠气道反应性情况,24h内迅速处死小鼠并取材[肺泡灌洗液(BALF)、脾脏及支气管肺组织]。苏木素-伊红染色法(HE)观察小鼠大体支气管肺组织病变、气道炎症细胞浸润、气道黏膜充血水肿等情况;阿辛蓝-过碘酸雪夫(AB-PAS)染色下主要观察气道杯状细胞及粘液分泌等情况。收集BALF行细胞分类及计数,并采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BALF上清液中IL-17的分泌水平;流式细胞术(FCM)检测脾细胞悬液中IL-17~+占γδT~+CD3~+淋巴细胞的百分比;实时定量荧光PCR(RT-PCR)检测肺组织RORγt m RNA的表达。结果成功复制了哮喘小鼠模型。与对照组比较,哮喘组小鼠气道炎细胞浸润及黏液分泌等显著增加,BALF中嗜酸粒细胞显著增多(P<0.05),予以不同浓度(6.25 mg/ml、12.5 mg/ml以及25 mg/ml)乙酰甲胆碱(Mch)激发后发现小鼠s Raw的表达显著高于对照组(P<0.05),表现出明显的气道高反应性;再者,哮喘组小鼠BALF上清液中细胞因子IL-17的分泌、脾细胞悬液中IL-17~+占γδT~+CD3~+淋巴细胞的百分比以及肺组织中RORγt m RNA表达量均出现显著增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论γδT17细胞通过分泌细胞因子IL-17参与哮喘的气道炎症过程,并在其致病机制中发挥着重要的致炎作用。第二部分γ分泌酶抑制剂(DAPT)对哮喘小鼠γδT17细胞的调控作用目的探讨γ分泌酶抑制剂(DAPT)特异性阻断Notch信号通路后对哮喘小鼠γδT17细胞的作用机制。方法按照随机数字表法将6~8周健康雄性SPF级Balb/c小鼠随机分为3组,即对照组、哮喘组以及DAPT干预组,每组6只。OVA致敏、激发制备哮喘动物模型。DAPT干预组在激发前30min予以γ分泌酶抑制剂(DAPT)雾化吸入。对照组予以PBS代替OVA造模并进行干预处理。各组在模型制作成功后24h内取材[肺泡灌洗液(BALF)、脾脏及支气管肺组织]。HE染色及AB-PAS染色镜下观察小鼠支气管肺组织炎细胞浸润、杯状细胞增生及气道黏液分泌等情况;ELISA法检测BALF上清液中IL-17的分泌水平;FCM检测脾细胞悬液中IL-17~+占γδT~+CD3~+细胞百分比情况;RT-PCR检测肺组织中RORγt m RNA的表达情况。同时,借助于免疫磁珠分选技术分选出小鼠脾脏单个核细胞悬液中γδT细胞,FCM检测小鼠γδT细胞分选的纯度;继而在细胞水平予以不同浓度DAPT(5μmol/L、10μmol/L以及20μmol/L)进行干预,检测DAPT特异性阻断Notch1信号通路对哮喘小鼠γδT17细胞比例的影响。结果(1)体内实验:与哮喘组相比,DAPT干预组小鼠气道炎症、管腔内黏液分泌及杯状细胞增生等情况显著减少,同时,小鼠BALF上清液中IL-17的表达、γδT~+CD3~+细胞中IL-17~+所占百分比以及肺组织RORγt m RNA的表达均出现明显减少,差异具有统计学意义(P<0.05)。(2)体外实验:磁珠分选小鼠脾脏γδT细胞,结果发现与对照组相比,哮喘组γδT~+细胞内IL-17~+所占百分比显著增高,同时予以不同浓度DAPT干预细胞后γδT17细胞比例出现明显降低(P<0.05),并且表现出随着DAPT浓度的增加呈现剂量依赖性的降低。结论γ-分泌酶抑制剂(DAPT)阻断Notch1信号通路后可以在一定程度上缓解哮喘小鼠的气道炎症反应,其作用机制与调控γδT17细胞的功能有关,对哮喘的免疫靶向治疗具有潜在的治疗价值。第三部分雾化吸入灭活草分支杆菌对哮喘小鼠Notch1信号通路的影响目的研究雾化吸入灭活草分支杆菌对哮喘小鼠Notch1信号通路的影响,从而探讨其可能的作用机制。方法随机数字表法将18只SPF级雄性Balb/c小鼠随机分为3组,即对照组、哮喘组以及处理组。采用OVA致敏、激发制备哮喘小鼠模型。处理组在每次激发前30分钟予以雾化吸入灭活草分枝杆菌杆菌,每天1次,连用5天。对照组予以PBS代替OVA造模并进行干预处理。模型制作成功后24h内处死小鼠并取材[肺泡灌洗液(BALF)、脾脏及支气管肺组织]。HE染色下观察小鼠肺组织大体病变、气道炎症细胞浸润以及气道黏膜充血水肿等情况;AB-PAS染色下主要观察气道杯状细胞及气道粘液分泌等情况;采用ELISA检测BALF上清液中相关细胞因子IL-17、IL-10、IL-4和IFN-γ的分泌情况;流式细胞术检测脾细胞悬液中IL-17~+γδT~+CD3~+淋巴细胞百分数;RT-PCR及免疫组织化学法(IHC)检测肺组织Notch1 m RNA和蛋白的表达情况;Western Blot检测肺组织NICD蛋白的表达情况。结果予以雾化吸入灭活草分支杆菌干预处理后,与哮喘组小鼠比较,发现处理组小鼠气道炎症及气道黏液分泌等情况明显减轻;同时,γδT17细胞比例及相关细胞因子IL-17的表达显著降低(P<0.05);再者,小鼠肺组织内Notch1受体m RNA及蛋白的表达亦存在显著差异(P<0.05)。结论Notch1受体m RNA及蛋白的表达在哮喘小鼠肺组织内表达显著增高,提示Notch信号与哮喘的发生发展过程密切相关,其机制可能与其调控γδT17细胞分泌细胞因子有关;雾化吸入灭活草分枝杆菌可以通过调控Notch1信号通路来影响γδT17细胞及相关细胞因子IL-17的分泌,从而减轻哮喘小鼠气道炎症反应。