背景：　　软骨缺损是临床工作中经常遇到的问题，软骨缺损以后，自我修复能力十分有限，因此，有关软骨缺损的研究和治疗在临床中意义重大。在耳鼻咽喉科领域最常见的为颈段气管软骨的缺损。很多先天性气管畸形、外伤或肿瘤侵袭常导致颈段气管大范围损伤、严重气管变形狭窄，最终导致患者呼吸困难而死亡。当前临床上最好的治疗手段是气管切开和气管重建治疗，而气管重建成功与否的关键在于气管软骨能否很好的端端吻合。当受损气管过多而切除过多时，通常不能进行直接吻合，只能进行重建来维持患者的呼吸生理功能。很多研究者试着运用同种异体软骨自体组织及人工材料移植物对切除气管重建，往往因为移植物本身免疫排斥及缺血感染坏死、吻合口裂开等原因，临床应用移植难以达到满意效果。　　软骨组织工程的兴起为临床上气管大量软骨缺损后气管重建的难题开辟了新的途径。软骨组织工程是利用可诱导成软骨的种子细胞在体外诱导成软骨，然后将诱导成的软骨移植于软骨缺损处，或者直接将种子细胞连同支架材料移植于软骨缺损处，随着时间的推移，种子细胞在体内逐渐诱导成软骨，支架材料慢慢吸收，从而修复软骨缺损达到临床上大量软骨缺损的治疗目的。目前脂肪间充质干细胞是软骨工程中应用最广泛的种子细胞。脂肪间充质干细胞具有良好的软骨诱导分化能力，因此在解决颈段大量气管软骨缺损修复重建方面具有良好的应用前景。既往前人实验只能将脂肪间充质干细胞诱导成软骨细胞，但无法获取一定体积及质量的软骨组织，而我们的前期研究发现，通过三维高密度法将脂肪间充质干细胞诱导成软骨细胞，再将诱导后的细胞做单层高密度培养可以获得了一定体积及硬度的软骨组织。我们设想，利用上述方法将脂肪间充质干细胞诱导成软骨组织，然后将诱导后的成软骨组织应用于颈段气管缺损重建，为临床上颈段气管缺损重建提供新的思路。本文主要从以下几个方面进行了论述。　　第一部分 脂肪间充质干细胞的提取、培养与鉴定　　目的：　　研究脂肪间充质干细胞获取、培养的的方法，观察脂肪间充质干细胞的形态及生长特性，为脂肪间充质干细胞成软骨组织诱导做基础。　　方法：　　以无菌技术切取健康SD大鼠腹股沟脂肪组织，应用0.1％I型胶原酶机械消化法，离心获取原代细胞，培养于含有15%FBS的DMEM培养基中，等细胞生长融合达到85%上下时，用0.25%胰蛋白酶消化法1:3传代培养，倒置显微镜观察细胞增值变化及形态，传代的细胞行流式细胞术鉴定脂肪间充质干细胞表面抗原分子CD90、CD44。结果　　脂肪间充质干细胞原代细胞12小时贴壁，开始呈梭形生长，细胞达到85%融合时，细胞规律排列生长传代后细胞形态逐渐均一，呈漩涡状生长。第5代细胞仍保持细胞稳定形态，流式细胞术鉴定传代表面抗原分子90%的细胞表达CD90、92%的细胞表达CD44。　　结论：　　自 SD大鼠双侧腹股沟组织中分离出的细胞为脂肪间充质干细胞，可以作为下一步软骨组织诱导的种子细胞。　　第二部分 脂肪间充质干细胞成软骨组织诱导及鉴定　　目的：　　探讨脂肪间充质干细胞经体外诱导成软骨组织的可行性，为体内颈段气管缺损修复重建实验奠定基础。　　方法：　　应用干细胞-藻酸盐微珠诱导法进行第5代脂肪间充质干细胞成软骨细胞诱导，诱导2周后将细胞从凝胶中释放并作免疫组织化学实验，检测软骨细胞特异性的Ⅱ型胶原蛋白的表达，鉴定软骨细胞生成，将诱导后的成软骨细胞提纯作单层高密度继续以软骨诱导培养基培养2周，观察诱导成软骨细胞的变化，获取一定体积及硬度的软骨样组织，行病理HE染色、免疫组化检测特异性软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白。　　结果：　　脂肪间充质干细胞-藻酸钙微球培养2周后呈现乳白色半透明改变，质地微韧，微球边缘略有溶解。微球释放出的细胞免疫组化实验可见特异性Ⅱ型胶原蛋白阳性表达。诱导后的成软骨细胞提纯作单层高密度继续培养2天后细胞贴壁状态逐渐改变，从培养皿底部慢慢分离；4天后慢慢卷曲形成膜状细胞层，细胞之间逐渐致密，细胞层逐渐增厚，体积逐渐缩小；1周时形成类圆形白色组织块，硬度增加；2周左右形成软骨样组织块。软骨样组织块经HE病理染色可见大量软骨类细胞基质形成，软骨陷凹形成，经免疫组化检测Ⅱ型胶原蛋白明显阳性表达。　　结论：　　脂肪间充质干细胞在凝胶中成软骨细胞诱导释放后提纯，再做单层高密度培养，能够诱导成软骨组织。　　第三部分 脂肪间充质干细胞成软骨诱导组织在颈段气管缺损重建中的应用　　目的：　　观察脂肪间充质干细胞成软骨诱导组织在颈段气管缺损修复重建的可行性，为脂肪间充质干细胞作为种子细胞软骨组织工程应用于临床气管软骨缺损重建提供新的思路。　　方法：　　制作SD大鼠颈段气管3、4气管环部分缺损模型6只，将诱导成的软骨组织联合颈前筋膜移植于气管缺损处修复重建气管，观察气管修复重建后大鼠呼吸、饮食、活动及成活情况，大鼠死亡者随机取出气管，成活者1月后处死取出气管行病理HE染色及免疫组化Ⅱ型胶原蛋白表达检测，观察移植物与正常气管生长融合情况。　　结果：　　诱导的软骨组织行气管缺损移植修补重建后的6只大鼠，均能够正常呼吸，成活时间12小时至1个月时间不等，1只因呼吸道分泌物死于12小时后，2例因肺部感染死于3天后，1例因手术口感染死于10天后，2只生存完好1月后处死。生存1月的大鼠重建气管病理检测可见移植物与缺损气管生长融合良好，并可见移植物软骨基质增多，软骨陷凹形成。气管内腔光滑内皮爬行生长良好。移植物部位免疫组化检测明显表达Ⅱ型胶原蛋白。　　结论：　　大鼠脂肪间充质干细胞成软骨诱导组织在体内生长良好，能够用来体内修复重建气管软骨缺损。