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【研究背景】转铁蛋白受体（Transferrin receptor,TfR）属于细胞膜Ⅱ型跨膜糖蛋白,作为细胞摄取铁的主要通道,其表达与细胞生命活动对铁的需求量有着密切关系。TfR在正常组织细胞中低表达。肿瘤细胞因快速分裂增殖,DNA合成、细胞能量供应等生命活动旺盛,需要合成更多的核糖核苷酸还原酶、DNA解旋酶、DNA聚合酶、细胞色素氧化酶等含铁酶,铁元素的需求量大幅增加,使得TfR在快速增殖的肿瘤细胞表面高表达,同时临床研究报道,TfR的表达上调与肿瘤患者预后不良密切相关,表明TfR可能成为嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor,CAR）T细胞疗法具有研究意义和应用价值的潜在靶点。【研究目的】本课题旨在前期构建抗TfR scFv、双价（TfR-Diabody）以及四价基因工程抗体（TfR-Tetravalent antibody）表达载体的基础上,进一步设计与构建新型抗TfR特异性二代CAR T细胞,通过体内外实验研究,探讨TfR-CAR T细胞的生物学特性及其抗肿瘤效应,为CAR T细胞治疗TfR+肿瘤研究奠定基础与提供实验依据。【实验方法】1.TfR-CAR T细胞的构建、表达与鉴定（1）通过全基因合成技术获得TfR-CAR基因（TfR scFv-CD8ahinge＆transmembrane region-4-1BB costimulatory domain-CD3z）,并克隆至慢病毒载体质粒,使用XbaⅠ和Eco RⅠ双酶切和基因测序鉴定Lenti-EF1a-TfR CAR-EGFRt质粒。制备TfR-CAR慢病毒,将慢病毒液倍比稀释转染293T细胞,用流式细胞术检测TfR-CAR分子表达水平,采用稀释计数法分析慢病毒滴度。（2）利用慢病毒转染系统将TfR-CAR基因转入人原代T细胞内,构建靶向TfR的二代CAR T细胞,用流式细胞术检测TfR-CAR T细胞的转染效率,同时提取TfR-CAR T细胞总蛋白,通过Western Blot检测CD3z链,验证TfR-CAR分子在T细胞中的表达。（3）TfR-CAR T细胞与CFSE标记的TfR+Hep G2肿瘤细胞在4℃环境下共孵育90 min,经过彻底洗涤,弃去非特异性黏附的T细胞,DAPI染色后封片,共聚焦显微镜下观察TfR-CAR T细胞与Hep G2细胞的结合情况。（4）流式细胞术检测TfR-CAR T细胞的细胞活性、免疫表型、Treg细胞和记忆性T细胞亚群分布。2.TfR-CAR T细胞的体外抗瘤效应（1）流式细胞术检测U266、Molt4、Kg1a、K562细胞表面TfR的表达。（2）TfR-CAR T细胞与Violet TM标记的U266、Molt4、Kg1a、K562、MX-1肿瘤细胞按照1:1、5:1和10:1的效靶比共孵育20 h,流式细胞术检测肿瘤细胞的7-AAD阳性百分率。（3）TfR-CAR T细胞与Violet TM标记的U266、Molt4、Kg1a、K562按照10:1的效靶比共孵育20 h,流式细胞术检测TfR-CAR T细胞活化标志CD25、CD69和细胞毒性标志Fas L、perforin、granzyme B的表达。（4）TfR-CAR T细胞与U266、Molt4、Kg1a、K562肿瘤细胞按照1:1、5:1和10:1的效靶比共孵育20 h,使用流式细胞术CBA多因子检测技术检测共孵育培养细胞上清中TfR-CAR T细胞的细胞因子分泌水平。3.TfR-CAR T细胞在T-ALL异种移植物模型中的抗肿瘤效应（1）用萤火虫荧光素酶慢病毒液转染Mollt4细胞,经嘌呤霉素筛选后,采用有限稀释点样法挑取Luc-Molt4单克隆细胞株。（2）尾静脉注射1×10~6 Luc-Molt4细胞至重度免疫缺陷的NPG小鼠体内,48小时后检测外周血中hu CD45+细胞百分比,将CD45+细胞百分率超过1%的小鼠随机分成三组。种瘤后的第3和第9天,尾静脉注射4×10~6 TfR-CAR T细胞、NCT细胞（Normal control,未经TfR-CAR慢病毒转染的T细胞）及等体积的生理盐水。每隔一天对小鼠进行称重,生物发光活体成像动态监测肿瘤进展,当有小鼠出现濒死症状时终止实验。（3）流式细胞术检测小鼠脾脏和外周血中TfR-CAR T细胞的免疫表型、Treg细胞和记忆性T细胞亚群分布。（4）流式细胞术CBA多因子检测技术检测血浆中TfR-CAR T细胞的细胞因子分泌水平。（5）肺脏、肝脏、肾脏组织切片行HE染色,观察是否存在病理学改变。（6）检测血浆中丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平。【实验结果】1.TfR-CAR T细胞的构建（1）XbaⅠ/Eco RⅠ双酶切鉴定和基因测序结果证实TfR-CAR基因序列正确,Lenti-EF1a-TfR-CAR-EGFRt载体质粒构建成功,流式细胞术分析表明制备的TfR-CAR T慢病毒滴度高达6.28×10~8TU/m L（>1×10~8TU/m L）,符合实验要求。（2）流式细胞术检测结果显示,用TfR-hu Fc融合蛋白、西妥昔单抗和抗F（ab’）2抗体三种方式检测的转染阳性率相近（79.2%～91.0%）;Western blot检测结果提示,CAR T细胞表达的TfR-CAR融合蛋白分子量大小为54 k Da,符合理论值大小,表明TfR-CAR T细胞构建成功。（3）共聚焦显微术结果显示TfR-CAR T细胞结合在Hep G2细胞周围形成“玫瑰花环”构型,而NC T细胞共孵育组未见T细胞与Hep G2细胞结合形成“玫瑰花环”构型,表明TfR-CAR T细胞能特异性结合TfR+Hep G2细胞。（4）流式细胞术分析表明TfR-CAR T细胞CD4+/CD8+T细胞亚群及Treg细胞比例与NC T细胞相比无明显区别,TfR-CAR T细胞中枢记忆性T细胞(TCM,CD45RO+CCR7+CD95+)亚群更为富集。2.TfR-CAR T细胞有效杀伤TfR+血液肿瘤细胞（1）流式细胞术检测结果显示,U266、Molt4、Kg1a、K562四株血液肿瘤细胞表面均高表达TfR。（2）与NC T细胞相比,TfR-CAR T细胞对U266、Molt4、Kg1a和K562均表现出更强的杀伤能力,且杀伤效应随着效靶比的增加而增强。不同个体来源的PBMCs（Peripheral blood mononuclear cells）制备的TfR-CAR T细胞表现出的杀伤活性存在较大差异,不同类型的肿瘤细胞对TfR-CAR T细胞介导的细胞杀伤效应的敏感性和响应强弱程度也不同。（3）TfR-CAR T细胞对TfR-肿瘤细胞MX-1的杀伤作用与NC T细胞相比无明显增强,表明TfR-CAR T杀伤效应具有靶点特异性。3.TfR-CAR T细胞能被靶细胞有效激活（1）流式细胞术检测结果显示,在与U266、Molt4、Kg1a、K562四株TfR+血液肿瘤细胞共孵育20 h后,不论是CD3+T细胞,或CD4+、CD8+T细胞亚群,TfR-CAR T细胞中活化标志CD25、CD69和细胞毒性标志Fas L、穿孔素以及颗粒酶的表达水平均显著高于NC T细胞。（2）流式细胞术CBA多因子检测结果显示,TfR-CAR T细胞的Th1和Th2型细胞因子分泌水平均高于NC T细胞,其中TfR-CAR T细胞的IFN-g,TNF-a分泌强度尤为显著。此外,不同个体来源的PBMCs制备的TfR-CAR T细胞的细胞因子分泌水平存在差异。4.TfR-CAR T细胞可有效抑制体内T-ALL肿瘤进展（1）生物发光活体成像结果显示随着时间的推移,TfR-CAR T细胞干预组可显著抑制小鼠体内肿瘤的进展,而生理盐水组和NC T细胞干预组小鼠体内肿瘤进展迅速,肿瘤负荷显著高于TfR-CAR T细胞干预组。（2）相较于TfR-CAR T细胞组,生理盐水组和NC T细胞组小鼠出现不同程度的体重下降,同时脾脏指数分析表明TfR-CAR T细胞治疗能有效减轻荷瘤小鼠的脾脏重量。（3）流式细胞术CBA多因子检测结果显示,与NC T细胞相比,TfR-CAR T细胞在体内分泌高水平的IFN-g。此外,IL-2、IL-10分泌水平也略有升高,但无统计学差异。（4）TfR-CAR T细胞组外周血和脾脏中的CD3+T细胞数量比例较NC T细胞组略微升高,但无统计学差异。外周血和脾脏中TfR-CAR T细胞CD69、穿孔素、颗粒酶和Fas L的表达显著高于NC T细胞。脾脏中TfR-CAR T细胞CD25的表达显著高于NC T细胞。TfR-CAR T细胞PD-1的表达和Treg细胞数量比例与NC T细胞相比均无显著性差异。（5）与NC T细胞比较,脾脏和外周血中TfR-CAR T细胞分化更集中在效应记忆性T细胞(TEM,CD45RO+CCR7-CD95+)亚群。（6）HE染色结果显示,与生理盐水组和NC T细胞组相比,TfR-CAR T细胞组小鼠各组织脏器无明显病理学改变。同时,血浆ALT/AST水平检测结果表明,与生理盐水组相比,NC T细胞组和TfR-CAR T细胞组小鼠外周血中ALT、AST水平均略有上升,但三组之间并无统计学差异。【实验结论】本课题研究结果表明:（1）成功构建TfR-CAR慢病毒载体,并利用慢病毒转染系统将TfR-CAR基因有效转入人原代T细胞中,构建了靶向TfR的二代CAR T细胞;（2）TfR-CAR T细胞能够特异性结合、杀伤TfR+肿瘤细胞,不同个体制备的TfR-CAR T细胞表现出的杀伤活性存在较大差异,不同类型的肿瘤细胞对TfR-CAR T细胞介导的细胞杀伤敏感性和响应强弱程度也不同,表明存在免疫效应细胞的个体差异性与肿瘤细胞的类别差异性;（3）TfR-CAR T细胞和TfR+肿瘤细胞共孵育后,能被靶细胞有效激活,促进T细胞活化标志CD25、CD69和细胞毒性标志Fas L、穿孔素和颗粒酶的表达,同时可分泌大量细胞因子发挥抗肿瘤效应;（4）在T-ALL异种移植物模型中,TfR-CAR T细胞能有效杀伤TfR+T-ALL细胞,抑制肿瘤的恶性进展,且无明显的系统生物学毒性,表明TfR可以成为CAR T细胞治疗血液系统肿瘤的靶点。