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糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一种由遗传和环境等因素长期作用引起的机体胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗造成的葡萄糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱而导致的全身性慢性代谢性疾病,其主要特征是高血浆葡萄糖水平。DM主要包括胰岛素依赖型的1型糖尿病(Type 1 Diabetes Mellitus,T1DM)、非胰岛素依赖型的2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)和妊娠糖尿病(Gestational Diabetes Mellitus,GDM)三种类型。其中T2DM的发病率占总发病率的90%以上,且呈现出日益增高的趋势,已成为严重威胁人类健康的一类重大疾病。虽然目前临床上有较多的抗T2DM药物,但口服剂型药物和注射剂型的多肽类药物均存在一定程度的副作用,安全有效的T2DM治疗药物依然比较缺乏。因此,研发安全有效的抗T2DM药物具有重要的科学意义和实用价值。虽然胰岛素抵抗从T2DM初期一直伴随到晚期,但相比之下胰岛β细胞功能的损伤却更能加重该病的进程。研究发现,糖脂毒性、线粒体紊乱、应激反应及炎症反应等都能诱导胰岛β细胞不断凋亡,加速β细胞的死亡,使β细胞数目大量减少,最终引起胰岛素分泌严重不足。因此,增强胰岛保护以改善β细胞功能对T2DM的治疗具有重要意义。此外,肝脏葡萄糖异生是机体内源性葡萄糖的重要来源,其生理意义是维持饥饿状态下机体血糖的稳态,以防止低血糖事件的发生。然而在T2DM中,胰岛素抵抗、胰岛素分泌不足和胰高血糖素血症都导致了肝脏糖异生过度活化及葡萄糖的输出增加,并且肝糖异生产生的葡萄糖正是T2DM患者体内高血糖的重要来源。因此,有效抑制肝脏过度糖异生以减少内源性葡萄糖生成,也是治疗T2DM的重要策略之一。由于胰岛?细胞功能缺陷及肝糖异生异常活化是T2DM高血糖产生的重要原因,本论文工作基于胰岛?细胞功能改善和肝糖异生抑制这两大策略,开展抗T2DM先导化合物的发现及作用机制研究,为抗T2DM治疗药物的开发奠定基础。本论文共分为三部分工作,基于胰岛?细胞功能改善和肝糖异生抑制策略,我们先后发现了3个抗T2DM药物先导化合物SP6616、DMT以及QVO前药IVQ,并开展了这些化合物的抗T2DM药效学评价及相关作用机制研究。在靶向胰岛?细胞功能改善的策略上,我们着重开展了与?细胞功能调控关系密切的钾离子通道的相关研究。电压门控钾离子通道kv2.1在促胰岛素分泌和?细胞生存保护中发挥重要的调节作用。因此,我们实验室前期建立了kv2.1抑制剂高通量筛选平台,并获得了结构新颖的kv2.1小分子抑制剂sp6616(ethyl-5-(3-ethoxy-4-methoxyphenyl)-2-(4-hydroxy-3-methoxybenzylidene)-7-methyl-3-oxo-2,3-dihydro-5h-[1,3]thiazolo[3,2-a]pyrimidine-6-carboxylate)。本论文工作中,我们首先验证sp6616作为一个新型kv2.1小分子抑制剂,在ins-1细胞系上具有促进高糖刺激的胰岛素分泌和抗胰岛?细胞凋亡双重药效活性;在2型糖尿病模型鼠db/db小鼠体内,发现该化合物能明显改善糖代谢,且在体内也具有促胰岛素分泌和胰岛?细胞保护的功能。在对sp6616作用机制研究过程中,我们发现sp6616通过抑制钾离子通道,导致电压门控钙离子通道开放,增加细胞外钙离子内流入细胞,从而促进高糖刺激的胰岛素分泌,该机制与已报道的钾通道抑制促胰岛素分泌的机制基本一致。由于kv2.1参与调节胰岛?细胞凋亡的分子机制还未见报道,我们以sp6616为分子探针进行了kv2.1调控胰岛?细胞凋亡机制研究,并首次发现kv2.1抑制保护?细胞的机制涉及proteinkinasesc(pkc)/extracellular-regulatedproteinkinases1/2(erk1/2)和calmodulin(cam)/phosphatidylinositol3-kinase(pi3k)/proteinkinaseb(akt)通路。sp6616在体内外实验中都表现出良好的促胰岛素分泌和抗胰岛?细胞凋亡的双重药效活性,而且作用机制也较为明确,可以作为一个新型的抗t2dm先导化合物进行开发。在靶向糖异生抑制的策略上,我们利用小鼠肝原代细胞开展了糖异生抑制剂的筛选工作,通过对实验室化合物库的筛选,发现了活性化合物dmt(2-(2,4-dimethoxy-3-methylphenyl)-7-(thiophen-2-yl)-9-(trifluoromethyl)-2,3-dihydropyrido[3’,2’:4,5]thieno[3,2-d]pyrimidin-4(1h)-one)和qvo((e)-3-(2-(quinolin-4-yl)vinyl)-1h-indol-6-ol),两者都能够明显拮抗胰高血糖素刺激的肝糖异生增加。在dmt的药效学评价中,我们发现dmt能够缓解db/db小鼠的糖尿病进程:显著降低db/db小鼠空腹血糖和糖化血蛋白(hemoglobina1c,hba1c)水平;明显改善口服葡萄糖耐量;改善丙酮酸耐量;抑制小鼠肝脏组织中葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase,g6pase)和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase,pepck)等糖异生基因的转录。对dmt的作用机制研究发现,dmt通过激活gαq/phospholipasec(plc)/inositol1,4,5-trisphosphate Receptor(IP3R)信号通路,增加内质网Ca2+释放进入细胞质,进而调控了PI3K/AKT/Forkhead Box Protein O1(FOXO1)信号通路,达到抑制糖异生的目的。本工作所发现的DMT具有良好的抗T2DM生物活性,作用机制明确,具备成为抗T2DM先导化合物的潜质。而另一个糖异生抑制剂QVO的化学结构骨架与小檗碱的母核相似,可以间接激动AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated Protein Kinase,AMPK)的活性,抑制糖异生。QVO的作用机制与小檗碱不完全相同,它对AMPK的上游肝激酶B1(Liver Kinase B1,LKB1),钙调蛋白依赖激酶的激酶β(Calcium/Calmodulin Dependent Protein Kinase Kinaseβ,CaMKKβ)和线粒体呼吸通路都有调节作用。由于活性化合物QVO化学合成路线复杂、产率低,我们开展了易于合成的前药设计工作,获得了目标化合物IVQ(4-[2-(1H-indol-3-yl)vinyl]quinolin)。通过代谢研究发现,IVQ在小鼠和大鼠体内可以有效转化成QVO,这说明了前药设计的正确性。我们在db/db和ob/ob两种T2DM动物模型上的实验结果显示,IVQ盐酸盐表现出良好的改善T2DM小鼠糖代谢水平的功能:能够显著降低小鼠空腹血糖和HbA1c;改善小鼠的口服葡萄糖耐量以及丙酮酸耐量。因此,IVQ可作为一个抗T2DM的先导结构的前药,值得进一步的开发研究。