随着耐药细菌的出现以及公众对农药危害的担忧,迫切需要新型药物和化学农药的环保替代品。枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性、需氧的芽孢杆菌,广泛分布在土壤及腐败的有机物中,易在枯草浸汁中繁殖,故名。该类菌株具有良好的分泌系统,能够产生多种具有广泛的抗菌活性的次生代谢产物,临床医学上属于安全性的有益微生物。它可利用蛋白质、多糖及淀粉,并可分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛,对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径及其调节机制研究较清楚。在药物设计领域,其作为先导成分的作用是不可替代的。本文结合培养条件的优化和前体介导的生物合成实验进行微生物的培养,从枯草芽孢杆菌（TJU01W1）代谢物的分离入手,寻找有活性的代谢产物,并提出了进一步研究和开发的前景。本论文主要从样品采集、微生物菌株的分离及保存、生物活性筛选、菌株形态、基于16S r DNA的菌株同源性分析、培养条件的优化、前体介导的生物合成实验、次级代谢产物的分离纯化及结构鉴定、生物活性测定等多个方面对分离自天津大学校园的枯草芽孢杆菌（TJU01W1）进行了研究。采集天津大学校园土壤样品6份,选择胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、营养琼脂（NA）、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、LA培养基、蔡氏培养基（CZA）等五种固体培养基,采用稀释法和平板法对土壤样品中的微生物进行分离,即首先对土壤样品进行一系列倍数稀释,然后在不同固体培养基表面均匀涂上浓度适宜的土壤样品稀释液。经过12-36小时培养后,土壤中的单个微生物细胞或孢子可以在培养基表面形成可见的菌落。然后将所需要的菌落通过平板划线法转移到相应的固体培养基上,12-36小时后用显微镜观察其形态确定是否为单一菌株,若不是,再重复上述操作直到得到纯菌株。通过生物活性实验筛选出一株对产青霉有较强抑制作用的菌株,命名为TJU01W1。其次,将筛选得到的TJU01W1菌株进行冷冻保存,首先将液体培养基、甘油、2 m L离心管、枪头等实验物品用高压灭菌锅在121℃下灭菌20 min;然后将所要保存的菌株接种于相应的液体培养基中,培养至对数生长期（培养系统浑浊度肉眼可见）;将菌悬液与甘油1:1等体积在超净台中混合（最终甘油浓度为50%）,用振荡器震荡均匀;最后将菌株保存于-80℃的冰箱中。为了研究菌株TJU01W1的生物学特性,我们首先对该菌株进行了16S r DNA序列同源性分析,首先采用CTAB法对该菌株的DNA进行提取,用分光光度法对提取的总DNA的纯度进行测定,使OD₂₆₀/OD₂₈₀的值在1.8±0.1,说明DNA的纯度较好,若低于1.7,说明提取的DNA中残留有较多的蛋白质;若大于2.0,说明有RNA污染或DNA链断裂。然后将该菌株的总DNA作为模板,用16S r DNA的通用引物27F（5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`）和1541R（5`-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3`）进行PCR扩增,最后将扩增后的产物采用琼脂糖凝胶电泳来确定扩增后的片段长度为目的片段长度;将扩增成功的PCR产物交由北京擎科生物科技有限公司进行测序,利用BLAST软件将测得的16S r DNA序列与Gen Bank中已知的16Sr DNA序列进行比对,选择属内同源性较高的16Sr DNA序列构建系统发育树,发现它与枯草芽抱杆菌（B.subtilis）相似性高达99%,初步确定归属于枯草芽抱杆菌（B.subtilis）。菌株鉴定后,为了刺激沉默的基因表达以获得新的结构或新活性的次级代谢产物,试图通过改变发酵条件来刺激不同代谢产物的合成,即使代谢产物类型基本一致,获得的粗提物的生物活性在不同培养条件下也可能会有所不同。结合实验室条件,从不同液体培养基组成、p H值以及不同添加剂如Na Cl、Ca CO₃、小麦面粉等角度研究了培养条件对菌株TJU01W1的生物量和次级代谢产物的影响,进而确定了大规模培养的发酵条件。培养基成分:蔗糖30 g/L,亚硝酸钠3g/L,氯化钾0.5 g/L,硫酸镁0.5 g/L,硫酸亚铁0.01 g/L,磷酸氢二钾1.0 g/L。培养温度:30℃。发酵液初始p H值:6.66。转速:200 r/min。培养时间:12天。装液量:1000 m L/2500 m L锥形瓶。本课题采用传统微生物发酵方法对枯草芽孢杆菌（TJU01W1）进行了大规模培养并累积获得15 L发酵液,首先对发酵液进行离心,用甲醇超声提取菌体沉淀,上清液分别用乙酸乙酯、正丁醇萃取,减压浓缩分别得到甲醇萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物,采用Diaion HP-20树脂填充柱对萃取物进行粗分得到不同的馏分,然后采用半制备型高效液相色谱对馏分进行分离纯化。最后,从正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物中共分离得到5个单体化合物。通过高分辨质谱、核磁共振谱等波谱技术确定了化合物的结构,分别为3,6-dimethylpyrazin-2（1H）-one（1）,Leuglycin（2）,C₁₃-surfactin（3）,C₁₄-surfactin（4）和C₁₅-surfactin（5）。化合物1和2均是第一次从枯草芽孢杆菌中分离得到,之前报道的吡嗪酮类化合物主要分离自其他细菌和真菌,化合物1是霍乱弧菌调节集体行为的信号分子,化合物2的同分异构体是形成酒体香气浓郁的主要因素。化合物3、4和5是枯草芽孢杆菌由非核糖体肽合成酶催化合成的典型的肽类次级代谢产物,该类化合物具有较强的抗菌活性。由于分离得到的代谢物结构均由不同的氨基酸组成,进而进行了前体介导的生物合成实验（喂养实验）研究。前体介导的生物合成是利用天然产物生产“非天然”的产物。虽然天然产物在药物发现中发挥着重要作用,但这些化合物的衍生物往往更有效,副作用更少。前体介导的生物合成为合成复杂的天然产物提供了机会。一旦证实了天然产物类似物的存在,代谢工程可用于提高产量和使前体选择性多样化。前体介导的生物合成即是通过在微生物培养的培养基中添加前体类似物来生成天然产生的生物活性化合物的衍生物。根据底物在生物合成途径中的特异性,添加的类似物应与天然前体具有相似的化学结构,可以被识别并随后被纳入到产物中。新合成的代谢物与之前的天然产物相比往往具有较强的稳定性、较强的生物活性和较低的副作用。本研究通过喂养实验向CZB培养基中加入一系列一到两种氨基酸,采用HPLC和LC-MS/MS分析这些氨基酸前体对次级代谢产物产量和多样性的影响。根据实验结果,一方面在正常的CZB培养基中加入相应的氨基酸前体进行HPLC定量分析或进一步大规模培养,分离纯化新的代谢产物;另一方面,由于分离出的表面活性素结构中含有亮氨酸单元且由于氟原子小的原子半径、大的电负性和小的极化率使其与碳原子形成共价键时,C-F键的键长很短,键能很大,因此氟的嵌入能够改变一个化合物的行为进而能够改善化合物的亲脂性,代谢稳定性,生物利用度和受体与活性部位的结合力,因此5,5,5-三氟-DL-亮氨酸被加入到培养基中,萃取物通过HPLC和LC-MS/MS分析观察代谢物。本课题也采用前体介导的生物合成实验对分离得到的化合物2的产量进行了优化,根据之前报道的吡嗪酮类化合物生物合成通路推测了化合物2的前体可能为甘氨酸和亮氨酸,于是分别向培养基中加入低（0.033 mol/L）、中（0.066mol/L）、高（0.132 mol/L）浓度的甘氨酸和亮氨酸,发现亮氨酸和甘氨酸均能在一定程度上提高化合物2的收率。在一定浓度下,亮氨酸和甘氨酸同时加入对化合物2合成效果要明显高于二者的单独添加,但并不是简单的加和关系。因此,化合物2的生物合成具有严格的特异性限速机制。此外,在相同浓度下,甘氨酸比亮氨酸更有利于化合物2的生物合成。培养基中色氨酸的加入使枯草芽孢杆菌（TJU01W1）产生了新的次级代谢产物并从其中分离出四个吲哚衍生物:3-Hydroxyacety-l-indole（6）,indole-3-carboxaldehyde（7）,1-acetyl-?-carboline（8）和pityriacitrin（9）,该类化合物首次从枯草芽孢杆菌中分离得到。此外,5,5,5-三氟-DL-亮氨酸的添加使得多达四个三氟亮氨酸被嵌入到surfactin中,从而产生了一系列不同的氟化表面活性素衍生物。用MS-MS进行了结构的验证并分析了5,5,5-三氟-DL-亮氨酸可能发生的生物转化,用奈斯勒试剂对5,5,5-三氟-DL-亮氨酸在生物转化过程中产生的铵根进行了定性检测,此外,由于氟化表面活性素（surfactin）的产率不理想,没有对其进行进一步分离。可以采取以下措施提高表面活性素的氟化率:（1）由于表面活性素结构中所含的四个亮氨酸均为L-亮氨酸,因此可以仅向培养基中添加5,5,5-三氟-L-亮氨酸代替5,5,5-三氟-DL-亮氨酸;（2）为了避免5,5,5-三氟-DL-亮氨酸生物转化引起的副产物的产生,可以加入酶抑制剂来抑制生物转化过程中起催化作用的酶。在抗菌活性方面,采用琼脂扩散法对枯草芽孢杆菌粗提物的活性进行评价。测试的菌种包括ATCC8043希氏肠球菌（Enterococcus hirae）,ATCC12600金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）,ATCC13525荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）,ATCC14990表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）,ATCC25175变形链球菌（Streptococcus mutans）,ATCC15692铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）,ATCC25238摩拉克氏菌属莫拉菌（Moraxella catarrhalis）等7种细菌。ATCC10106产黄青霉菌（Penicillium chrysogenum）,ATCC76615白色念珠菌（Candida albicans）,ATCC2601酵母菌（Saccharomyces kudriavzevii）,ATCC22019近平滑念珠菌（Candida parapsilosis）,ATCC10571皱褶念珠菌（Candida rugosa）,ATCC750热带念珠菌（Candida tropicalis）,ATCC16888黑曲霉（Aspergillus niger）,ATCC34103匍枝根霉菌（Rhizopus stolonifer）等8种真菌。结果表明粗提物对细菌ATCC12600金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）,ATCC14990表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）,ATCC25238摩拉克氏菌属莫拉菌（Moraxella catarrhalis）以及真菌ATCC10571皱褶念珠菌（Candida rugosa）,ATCC10106产黄青霉（Penicillium chrysogenum）的生长有明显的抑制作用。MIC实验主要针对分离得到的纯化合物,实验结果表明表面活性素对细菌的生长有较明显的抑制作用,尤其针对ATCC12600金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和ATCC14990表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）,该结果与之前文献报道的结果是一致的。此外采用琼脂扩散法比较了加入5,5,5-三氟-DL-亮氨酸后产生的含氟化表面活性素的萃取物与未加5,5,5-三氟-DL-亮氨酸的对照组的抗菌活性,结果表明添加5,5,5-三氟-DL-亮氨酸的甲醇萃取物与对照组相比对金黄色葡萄球菌ATCC12600、表皮葡萄球菌ATCC 14990、卡他莫拉菌ATCC 25238均表现出较强的抗菌活性。本课题从枯草芽孢杆菌TJU01W1中首次分离出两个吡嗪酮类化合物和四个吲哚类衍生物,氟化表面活性素也通过LC-MS被检测到,且与对照组相比表现出较强的抗菌活性,推测其具有理想的生物活性,具有广阔的发展前景。