论文部分内容阅读
目的：观察细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer,CIK)对耐顺铂(DDP)人肺腺癌细胞系A549/DDP的耐药逆转作用及其逆转A549/DDP耐药的可能机制。探讨CIK分泌的细胞因子在其逆转A549/DDP顺铂耐药性中的可能作用。方法：四氮甲唑兰比色法(MTT法)检测A549及A549/DDP的DDP敏感性,计算其半数抑制浓度IC50,验证A549/DDP的DDP耐药性。RT-PCR法从耐药相关基因中筛选A549与A549/DDP有差异表达的基因作为检测DDP耐药性变化的观察指标。CIK细胞与A549/DDP采用transwell非接触共培养,分别置于transwell小室的上、下层,共培养时间设为6h、12h、16h、20h,单独培养的A549、A549/DDP作为对照组,分别收集不同组细胞通过MTT检测其DDP耐药性的变化,实时定量PCR及Western blot检测各组细胞耐药相关基因及蛋白表达水平的变化。收集不同时间点CIK与A549/DDP的共培养上清,ELISA法检测IFN-γ、TNF-α、IL-2的分泌情况。将共培养不同时间点的细胞因子分泌量与对应时间点的耐药逆转系数做相关分析,分析细胞因子是否与耐药逆转相关。再设实验组为A549/DDP与CIK非接触共培养20h组、加或不加中和抗体组,对照组为单独培养的A549、A549/DDP,通过MTT检测各组细胞的DDP耐药性的变化,实时定量PCR及Western blot检测各组细胞耐药相关基因表达水平的变化。高效液相色谱分析(HPLC)检测不同组细胞内DDP的浓度。结果：A549/DDP相对于A549的耐药系数为14.5(IC50:72.6±4.65μmol/Lvs.5.0±1.25μmol/L),具有较强的DDP耐药性。HPLC结果显示A549/DDP内DDP浓度较A549明显降低(0.29±0.02μg/ml vs1.50±0.03μg/ml, P<0.05)。 RT-PCR筛选出A549与A549/DDP表达有差异的耐药相关基因包括谷胱甘肽转移酶π(glutathione-S-transferase,GST-π)基因、人类铜离子转运蛋白(human copper transporter1,hCTRl)基因、多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance protein1, MRP1)基因,A549/DDP中GST-π与MRP1表达量较A549明显增加,而hCTRl表达量明显降低。与CIK细胞共培养后,A549/DDP对DDP的耐药性明显下降,且耐药性的下降具有时间依赖性,共培养6h的A549/DDP与共培养12h的A549/DDP两者IC50的差异有明显统计学意义(P=0.026),但共培养12h、16h及20h的A549/DDP,此三者IC50差异无统计学意义,共培养20h后耐药逆转倍数约为4.93倍；,与CIK共培养20h后的A549/DDP内DDP浓度为0.99±0.02μ g/ml,较单独培养A549/DDP明显增高(P<0.05)。共培养20h后A549/DDP细胞内GST-π基因及蛋白水平的表达量较单独培养A549/DDP明显降低(P<0.05),hCTRl的表达量的变化无显著差异,MRP1在基因水平的的表达量升高。ELISA检测及相关分析发现IFN-γ的分泌与A549/DDP的耐药逆转明显相关。给予anti-IFN-γ抗体中和后,共培养20h A549/DDP的DDP耐药性明显上升,内DDP浓度为0.50±0.01μg/ml,较未加入者(0.99±0.02μg/ml)明显降低(P<0.05)。GST-π基因水平的表达量较未加中和抗体组也显著增加(P<0.05)。结论：CIK可以部分逆转耐药顺铂肺腺癌细胞A549/DDP的DDP耐药性。CIK逆转A549/DDP的DDP耐药过程中A549/DDP中GST-π的表达量发生相应变化,提示GST-π的表达量变化可能是A549/DDP耐药性逆转的机制之一。CIK通过分泌IFN-γ下调A549/DDP中GST-π的表达来实现其逆转耐药。