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高原特殊复杂的生态环境和多变的地理条件使移居和新进高原环境的人群出现高原反应或低氧相关的疾病。低氧、低压、太阳辐射强、昼夜温差大和干燥是发生高原反应或高原疾病的主要原因。其中低氧是关键性的因素。高原低氧环境对机体的影响是广泛的、非特异性的,涉及心血管系统、呼吸系统、神经系统、消化系统、免疫系统等,从而影响机体的功能、代谢和形态结构。近些年的研究发现高原低氧暴露还可以导致新进或移居人群发生血栓栓塞事件。高原低氧暴露可以诱导血栓形成,这在与低氧相关的活动和疾病中也得到了印证,例如:高海拔攀登活动、新生儿缺氧以及阻赛性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者等,然而低氧暴露诱导血栓形成的原因和分子机制报道甚少。既往研究显示高原急性低氧暴露会导致血小板活性增高、聚集反应增加和蛋白表达谱发生改变,这是急性低氧暴露诱导血栓形成的主要原因,然而慢性高原低氧暴露诱导血小板活化和血栓形成及其背后的分子机制目前尚未报道。基因芯片技术由于具有快速、高通量、敏感和高效率特点,被广泛应用于多种疾病的基因表达谱分析,寻找与疾病相关的特异基因,并解释基因的功能和疾病的分子机理。有研究者应用基因芯片技术检测了镰状细胞病、系统性红斑狼疮和原发性血小板减少症等疾病患者的血小板基因表达谱,发现了导致这些疾病发生的差异表达基因。因此本研究以血小板为研究对象借助于基因芯片技术比较了平原组和高原组健康人血小板基因表达谱,以了解慢性高原低氧暴露对血小板相关基因表达的影响,并通过生物信息学分析差异表达基因的功能了解慢性高原低氧暴露诱导血栓形成的可能机制。本研究旨在研究慢性高原低氧暴露对血小板基因表达和活化功能的影响以及与血栓形成之间的关系,有重要的临床意义,为进一步揭示慢性高原低氧暴露诱导血栓形成提供更多的理论依据。目的:研究慢性高原低氧暴露对健康人和大鼠血小板的数目、基因表达谱和活化功能的影响,探讨血小板在慢性低氧暴露导致血栓形成过程中可能发挥的作用。本研究内容包括两个方面的内容:(1)慢性高原低氧暴露对人血小板基因表达谱和活化功能影响的研究;(2)慢性低氧暴露对SD大鼠血小板基因表达和活化功能影响的研究。方法:我们在平原地区(50m)募集了39名健康男性,在高原地区(3700 m)募集了首次在该地区居住2月以上的40名健康男性,并采集了每个志愿者的临床数据,现场从肘静脉抽血并进行全血细胞分析和分离血小板。用Gene Chip? Prime View?Human Gene Expression Array Affymetrix m RNA芯片检测了平原组和高原组健康人血小板基因表达谱并筛选出差异表达基因,通过GO功能富集分析和生物学通路富集分析筛选出与血小板功能活动密切相关的差异基因,并应用荧光实时定量PCR和Western blot验证这些差异表达的基因。ELISA法检测了两组人群富血小板血浆(PRP,platelet rich plasm)样本中血小板因子4(PF4)和二磷酸腺苷(ADP)的表达水平。血块退缩实验(Clot retraction)比较了平原组和高原组健康人血小板的退缩能力,共聚焦检测了两组人群血小板在纤维蛋白原表面黏附和铺展的能力,用透射电镜观察两组人群血小板形态变化及胞内超微结构的变化,如α颗粒的释放。根据第一部分的研究结果,我们选择SD大鼠继续进行了验证,26只清洁级Sprague-Dawley雄性大鼠,随机分为2组,常氧组13只(北京,50 m),低氧组(4000 m)13只,荧光实时定量PCR检测常氧组和低氧组大鼠血小板GP4、GP6、GP9、GP1BB、ITGA2B、ITGB3、P2Y12、SELP的m RNA表达情况,Western blot检测两组大鼠血小板上述基因的蛋白表达情况。断尾实验比较两组大鼠断尾后止血时间,从而评估低氧暴露对生理性止血功能的影响。ELISA法检测了两组大鼠贫血小板血浆(PPP,platelet poop plasm)样本中PF4和β-TG的表达水平,血块退缩实验比较了两组大鼠血小板的退缩能力。共聚焦检测了两组大鼠血小板与纤维蛋白原结合后铺展的面积的大小。结果:(1)高原组较平原组健康人血小板数目减少,慢性高原低氧暴露改变了健康人血小板的基因表达谱,满足FDR<0.05的基因共有3445个,相对于平原组健康人,高原组人血小板表达上调的基因有901个,表达下调的基因有2544个,通过GO分析和生物学通路分析显示差异表达基因富集在与血小板功能活动相关的通路中,包括:凝血、止血、血小板活化、信号转导、聚集和脱颗粒反应等。荧光实时定量PCR和Western blot结果显示GP4、GP6、GP9、ITGA2B、SELP和PF4V1的m RNA和蛋白表达均增加(P<0.05)。高原组健康人血小板胞内α颗粒的数目减少,PF4和ADP的表达水平均高于平原组健康人。高原组健康人血小板与纤维蛋白原结合后,血小板铺展面积大于平原组健康人血小板铺展面积(P=0.0003),差异有统计学意义。血块退缩实验显示高原组健康人PRP样本发生血块退缩后的面积无论在30 min(P=0.0095)还是120 min(P=0.0043)均小于平原组健康人,差异有统计学意义。(2)慢性低氧暴露组大鼠血小板计数较常氧组大鼠减少(P=0.000),差异有统计学意义。荧光实时定量PCR结果显示慢性低氧暴露组大鼠血小板GP4、GP6、GP9、GP1BB、ITGA2B、ITGB3、SELP的m RNA表达较常氧组大鼠增高(P<0.05),差异有统计学意义,ADP受体P2Y12在两组之间表达无差异。Western blot结果显示GP4、GP6、GP1BB、ITGA2B、SELP的蛋白表达水平较常氧组大鼠血小板均增高(P<0.05),差异有统计学意义。低氧暴露组大鼠PPP样本中PF4和β-TG的表达水平均高于常氧组大鼠,差异有统计学意义。功能实验结果显示慢性低氧暴露环境可以诱导大鼠血小板活化,低氧暴露组大鼠断尾后出血时间明显少于常氧组大鼠(P=0.000),差异有统计学意义。低氧组大鼠血小板与纤维蛋白原结合后,其铺展面积明显大于常氧组大鼠血小板铺展面积(P=0.0002),差异有统计学意义。两组大鼠血块退缩的能力比较,低氧暴露组大鼠血块退缩后面积无论是30 min(P=0.004)还是120 min(P=0.002)均小于常氧组大鼠,差异有统计学意义。结论:慢性高原低氧暴露使血小板计数下降,表型发生改变,血小板基因表达谱发生改变,膜蛋白受体(GP4、GP9、GP6、ITGA2B、GP1BB、SELP)和趋化因子(PF4V1)表达增加,其超微结构发生改变胞内α颗粒脱出,颗粒内容物PF4、ADP和β-TG释放增加,同时血小板活性增强,功能试验显示血小板的铺展、血块退缩能力增强,出血时间缩短,这可能是慢性低氧暴露导致血栓形成的主要原因。