第一部分PPARy与线粒体自噬在缺氧性RTEC损伤中的表达及作用目的:通过构建缺氧致损伤的肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cell,RTEC)模型,检测细胞中的过氧化物酶体增殖物激活受体y(Peroxisome proliferators activated receptor γ,PPARγ)的 mRNA 和蛋白的表达及线粒体自噬相关指标等的变化,初步探讨PPARy与线粒体自噬在缺氧损伤的RTEC中的表达及作用。方法:将体外培养的RTEC随机分成3个组:正常组(Normal group,Normal)、缺氧损伤18小时后复氧1小时组(hypoxia for 18 hours and reoxygenation for 1 hour group,H/R18)和缺氧损伤24小时后复氧1小时组(hypoxia for 24 hours and reoxygenation for 1 hour group,H/R24)。Normal组细胞置于箱温为37℃,含有5%CO2和95%空气的二氧化碳培养箱中培养。H/R18组和H/R24组细胞均置于缺氧小室中,通入缺氧混合气体(成分为5%CO2和95%N2)后,将缺氧小室密封并放入37℃生化培养箱内。分别于缺氧18小时和24小时后取出细胞,转移至二氧化碳培养箱内复氧1小时,最后收集细胞检测相关指标。应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(real time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测 RTEC 中线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mt DNA)拷贝数、PPARy、Bax、LC3Ⅱ及 Atg5的mRNA表达,应用蛋白免疫印迹(western blot,WB)法检测RTEC中PPARγ、Bax、LC3Ⅱ、Atg5、SQSTM1/P62 及 PINK1 的蛋白表达;应用CCK-8试剂盒检测各组细胞的活性。采用线粒体膜电位(Mitochondria membrane potential,MMP)检测试剂盒检测MMP的变化;采用活性氧(Reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒检测ROS的产生;采用ATP检测试剂盒检测ATP的产生;采用光学倒置显微镜观察各组RTEC的形态变化;采用透射电镜(transmission eiection microscope,TEM)观察细胞内线粒体超微结构和线粒体自噬体(autophagosome,AP);应用激光共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)检测线粒体自噬体和自噬溶酶体(autolysosome,AL)。结果:1.与Normal组比较,H/R18组和H/R24组RTEC中mt DNA拷贝数、PPARγ的mRNA表达明显降低(均P<0.05),Bax、LC3Ⅱ及Atg5的mRNA表达明显升高(均P<0.05)。与H/R 18组比较,H/R24组RTEC中mt DNA拷贝数、PPARγ的mRNA表达明显降低(均P<0.05),Bax、LC3Ⅱ及 Atg5 的 mRNA 表达明显升高(均P<0.05)。2.与Normal组比较,H/R18组和H/R24组RTEC中PPARγ的蛋白表达明显降低(均P<0.05),Bax、LC3Ⅱ、Atg5、SQSTM1/P62 及 PINK1的蛋白表达明显升高(均P<0.05)。与H/R18组比较,H/R24组RTEC中PPARy 的蛋白表达明显降低(P<0.05),Bax、LC3Ⅱ、Atg5、SQSTM1/P62及PINK1的蛋白表达明显升高(均P<0.05)。3.与Normal组比较,H/R18组和H/R24组RTEC的细胞活力明显下降(均P<0.05),显微镜下发现细胞密度均减少。与H/R18组细胞比较,H/R24组的细胞活力明显下降(P<0.05),细胞密度明显减少,部分细胞形态狭长。4.与Normal组比较,H/R18组和H/R24组细胞中MMP、ATP浓度均明显降低(均P<0.05),ROS水平明显升高(均P<0.05)。与H/R18组比较,HR24组细胞中MMP、ATP浓度均明显降低(均P<0.05),ROS水平显著升高(P<0.05)。5.与Normal组比较,H/R18组和H/R24组RTEC中TEM下线粒体肿胀,线粒体嵴模糊或消失,可观察到线粒体自噬体。与H/R18组比较,H/R24组RTEC中线粒体肿胀更明显,线粒体嵴模糊或消失,线粒体空泡化。6.与Normal组比较,LSCM下H/R18组和H/R24组RTEC中可观察到线粒体自噬体及自噬溶酶体。与Normal组比较,H/R18组和H/R24组RTEC中含有线粒体自噬体及自噬溶酶体的RTEC 阳性率显著升高(均p<0.05)。与H/R18组比较,H/R24组RTEC含有线粒体自噬体体及自噬溶酶体的RTEC 阳性率显著升高(均pp<0.05)。7.相关分析显示,PPARy表达与LC3Ⅱ、Bax、PINK1及含有线粒体自噬的RTEC的阳性率呈显著负相关(均pp<0.05),但与细胞活性、MMP及ATP呈显著正相关(均p<0.05)。结论:在缺氧所致损伤的RTEC中,PPARγ表达显著降低,线粒体自噬显著增强,两者参与了 RTEC的损伤过程。第二部分PPARy通过线粒体自噬减轻缺氧性RTEC损伤的作用机制目的:通过药物干预体外培养的RTEC中PPARy的表达,以及转染慢病毒载体干扰体外培养的RTEC中PPARγ的表达,探讨PPARγ受体通过线粒体自噬减轻缺氧性RTEC损伤的作用机制。方法:体外培养RTEC,给予缺氧处理前分别以罗格列酮(Rosiglitazone,Rosi)、GW9662 干预后,分为 5 个组:Normal 组、H/R组、Rosi干预后缺氧损伤组(H/R+Rosi组)、GW9662干预后缺氧损伤组(H/R+GW9662组)、DMSO干预后缺氧损伤组(H/R+DMSO组);构建PPARy过表达慢病毒(PPARγ-OE)、PPARγ沉默表达慢病毒(PPARy-SE)以及阴性对照(neg)慢病毒载体,并对体外培养的RTEC进行转染,分为5个组:Normal组、H/R组、过表达PPARγ后缺氧损伤组(H/R+OE组)、沉默表达PPARγ后缺氧损伤组(H/R+SE组)和转染阴性慢病毒载体进行干扰后缺氧损伤组(H/R+neg组)。正常组RTEC不做任何处理,H/R组RTEC只做缺氧处理,药物干预组在缺氧处理前给予Rosi、GW9662干预,转染慢病毒载体后的各组细胞于转染96小时后构建缺氧模型。构建缺氧模型的方法同第一部分。缺氧处理18小时复氧1小时后收集各组细胞检测相关指标。TEM观察RTEC各组形态的变化。余检测指标及方法同第一部分。结果:1.与Normal组比较,H/R组RTEC中mt DNA拷贝数、PPARy的mRNA表达显著降低(均p<0.05),Bax、LC3Ⅱ、Atg5的mRNA表达均显著升高(均P<0.05)。与H/R组相比,H/R+Rosi组及H/R+OE组中mt DNA拷贝数、PPARy的mRNA表达均显著升高(均pp<0.05),Bax、LC3Ⅱ、Atg5 的 mRNA 表达均显著降低(均 P<0.05)。而 H/R+GW9662组及H/R+SE组中mt DNA拷贝数、PPARγ的mRNA表达均显著降低(均pp<0.05),Bax、LC3Ⅱ、Atg5的mRNA表达均显著升高(均P<0.05)。H/R+DMSO 组及H/R+neg 组的 mt DNA 拷贝数、PPARy、Bax、LC3Ⅱ、Atg5的mRNA表达与H/R组无显著差异(均p>0.05)。2.与Normal组比较,H/R组RTEC中PPARγ的蛋白表达显著降低(p<0.05),Bax、LC3Ⅱ、Atg5、SQSTM1/p62 及 PINK1 的蛋白表达均显著升高(均P<0.05)。与H/R组相比,H/R+Rosi组及H/R+OE组中PPARγ的蛋白表达显著升高(均P<0.05),Bax、LC3Ⅱ、Atg5、SQSTM1/p62及PINK1的蛋白表达均显著降低(均P<0.05)。而H/R+GW9662组及H/R+SE组中PPARγ的蛋白表达显著降低(均p<0.05),Bax、LC3Ⅱ、Atg5、SQSTM1/p62 及 PINK1 的蛋白表达均显著升高(均 P<0.05)。H/R+DMSO 组及 H/R+neg 组的 PPARy、Bax、LC3Ⅱ、Atg5、SQSTMl/p62及PINK1的蛋白表达与H/R组无显著差异(均 p>0.05)。3.与Normal组比较,H/R组RTEC活力显著降低(P<0.05),细胞肿胀明显。与H/R组相比,H/R+Rosi组及H/R+OE组中RTEC活力显著升高(均P<0.05),细胞肿胀减轻。而H/R+GW9662组及H/R+SE组中RTEC活力显著降低(均p<0.05),细胞肿胀明显,形态不规则。H/R+DMSO组及H/R+neg组的RTEC活力较H/R组无显著差异(均p>0.05),细胞形态较H/R组无明显变化。4.与Normal组比较,H/R组RTEC中MMP、ATP浓度显著降低(均P<0.05),ROS水平显著升高(P<0.05)。与H/R组相比,H/R+Rosi组及H/R+OE组中RTEC中MMP、ATP浓度显著升高(均P<0.05),ROS水平显著降低(P<0.05)。而H/R+GW9662组及H/R+SE组中RTEC中MMP、ATP浓度显著降低(均P<0.05),ROS水平显著升高(P<0.05)。H/R+DMSO 组及H/R+neg 组的 MMP、ATP 浓度、ROS 水平与H/R组无显著差异(均P>0.05)。5.与Normal组比较,H/R组TEM下RTEC线粒体肿胀,线粒体嵴模糊或消失,可观察到线粒体自噬体。与H/R组相比,H/R+Rosi组及H/R+OE组中RTEC线粒体稍肿胀,未观察到线粒体自噬体。而H/R+GW9662组及H/R+SE组中RTEC中线粒体结构异常更明显,可观察到线粒体自噬体。H/R+DMSO组及H/R+neg组的线粒体结构与H/R组相比无显著差异。6.与Normal组比较,H/R组LSCM下RTEC中可观察到线粒体自噬体及自噬溶酶体。与H/R组相比,H/R+Rosi组及H/R+OE组中RTEC线粒体自噬体及自噬溶酶体阳性率显著降低(均P<0.05)。而H/R+GW9662组及H/R+SE组中RTEC中线粒体自噬体及自噬溶酶体阳性率显著升高(均P<0.05)。H/R+DMSO组及H/R+neg组的RTEC线粒体自噬体及自噬溶酶体阳性率与H/R组无显著差异(均p>0.05)。7.相关分析显示,PPARy蛋白表达与LC3Ⅱ、Bax、PINK1及含有线粒体自噬体细胞的阳性率呈显著负相关均呈负相关(均p<0.05),但与细胞活性、MMP、ATP浓度均呈正相关(均p<0.05)。结论:在缺氧诱导损伤的RTEC中,上调PPARy的表达减轻缺氧性损伤,下调PPARy的表达加重缺氧性损伤。其机制可能与上调PPARy表达可促进线粒体功能恢复及抑制线粒体自噬有关。