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伪狂犬病(Pseudorabies,PR),也称为奥耶斯基氏病(Aujeszky’s disease,AD),是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种以种猪繁殖障碍、新生仔猪大量死亡为特征的急性传染病。为了控制国内PR的流行,1979年中国从匈牙利引进了基因缺失疫苗Bartha-K61,PR得到了较好的控制。然而,自2011年末以来,国内许多传统疫苗Bartha-K61免疫的猪场频繁暴发PR,对养猪业造成了巨大的经济损失。研究表明,引起免疫猪场暴发PR的是一种PRV变异毒株,相比经典PRV,变异PRV表现出了更强的毒力和致病力。对国内新分离的PRV变异毒株进行系统的遗传演化分析,结果表明,国内流行的PRV变异株与国外流行株处于遗传演化的两个分支,指示PRV可能存在两种基因型。因此,我们提出猜想:与疫苗株相比,PRV变异株的主要保护性抗原基因可能发生了变异,结果导致疫苗株免疫不能有效抵抗PRV变异株的感染。于是,我们对本实验室分离到的PRV变异毒株JS-2012进行了生物信息学分析,结果表明:与疫苗株Bartha-K61相比,PRV变异株JS-2012的主要保护性抗原gB、gC和gD的氨基酸序列发生了不同程度的变异。为了探究保护性抗原gB、gC、gD的变异与Bartha-K61免疫不保护现象的关系,我们开展了以下研究。1.基因互换重组PRV的构建。使用CRISPR/Cas9与HDR结合的技术,以Bartha-K61和JS-2012-ΔgE/gI(参照Bartha-K61人工缺失gE和gI基因的JS-2012株)为骨架,成功构建了gB基因互换的重组病毒BJB和JBJ、gC基因互换的重组病毒Bar-JSgC和JS-BargC、gD基因互换的重组病毒Bar-JSgD和JS-BargD以及gB/gC/gD三基因同时互换的重组病毒Bar-JSgBgCgD和JS-BargBgCgD。2.重组PRV的体外生物学特性研究。基因替换的重组病毒与其亲本病毒的体外生物学特性较为相似。其中,与亲本毒株JS-2012-ΔgE/gI相比,JS-BargC在PK-15细胞上的复制能力显著降低。3.小鼠交叉免疫保护试验。将重组PRV及其亲本毒株Bartha-K61和JS-2012-ΔgE/gI分别制备成灭活疫苗,免疫小鼠,再攻击PRV变异株JS-2012。结果表明,gB替换显著地改变了其亲本病毒Bartha-K61或JS-2012-ΔgE/gI对变异株JS-2012攻击的交叉免疫保护效果;gC或gD替换对变异株JS-2012攻击的交叉免疫保护效果的影响不明显,荧光定量PCR的结果表明,gC和gD的变异在一定程度上改变了Bartha-K61的免疫原性。综上所述,本研究通过CRISPR/Cas9与HDR结合的技术,成功构建了gB、gC、gD单基因替换和多基因替换的PRV重组病毒,并通过小鼠免疫保护试验证明了gB替换能够显著改变Bartha-K61和JS-2012-ΔgE/gI的免疫原性,提示疫苗株免疫对变异株不保护现象与gB变异密切相关。gC和gD的变异在一定程度上改变了Bartha-K61的免疫原性。以上研究为揭示PRV毒株间变异和免疫逃避机制提供了理论基础。