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研究背景近年来由于环境污染及饮食结构的改变,支气管哮喘的患病率逐年上升,各国支气管哮喘的患病率从1%-16%不等。目前全球支气管哮喘患者约有3亿,而我国有高达约3000万。支气管哮喘因气道重塑导致气道炎症和狭窄病理改变,最终造成长期呼气性呼吸困难,直至呼吸衰竭。目前认为多种炎症细胞因子促进上皮-间质细胞转化(EMT)在支气管哮喘的气道重塑过程中发挥重要作用。溴结构域蛋白4(BRD4)参与肿瘤增殖、转移和炎症信号转导等过程,我们前期研究发现在支气管哮喘小鼠气道组织中BRD4的mRNA和蛋白水平显著增高,BRD4特异性抑制剂JQ1可显著地抑制支气管哮喘小鼠的气道重塑,但具体的机制不明。研究目的:探讨BRD4介导NF-κB通路调控EMT参与支气管哮喘气道重塑的作用及分子机制,为支气管哮喘的治疗和气道重塑的早期预防提供理论依据和可能的治疗新靶点。实验方法:第一部分探究NF-κB通路对气道上皮EMT过程的调控机制1.HBE细胞培养、HE染色及细胞免疫荧光染色等方法,观察TGF-β1刺激人支气管上皮(HBE)细胞72h细胞形态、表型变化及细胞表型蛋白表达;以及经NF-κB siRNA转染HBE细胞,再经TGFβ1刺激培养(72h),采用HE染色和细胞免疫荧光法观察细胞形态和表型变化及细胞表型蛋白表达变化。2.采用qRT-PCR和Western blot法检测NF-κB siRNA转染的HBE细胞经TGFβ1刺激后HBE细胞中NF-κB、EMT相关转录因子Snail和细胞表型基因Vimentin、Ecadherin的mRNA和蛋白表达水平的变化。第二部分探讨BRD4介导NF-κB通路调控EMT参与哮喘气道重塑过程中的作用及分子机制1.采用BRD4 siRNA转染HBE细胞,经TGFβ1刺激BRD4 siRNA转染的培养HBE细胞,运用HE染色和细胞免疫荧光染色观察细胞形态和表型及细胞表型蛋白表达变化。2.采用qRT-PCR和Western blot法检测BRD4干扰后对TGFβ1刺激的HBE细胞NF-κB、EMT相关转录因子Snail和细胞表型基因Vimentin、Ecadherin的mRNA和蛋白表达的影响。3.BRD4特异性抑制剂JQ1与TGFβ1刺激的HBE细胞共同培养,HE染色和细胞免疫荧光染色观察细胞形态和表型变化及细胞表型蛋白表达变化;以及qRT-PCR和Western blot法检测NF-κB、EMT相关转录因子Snail和细胞表型基因Vimentin、Ecadherin的mRNA和蛋白表达的影响。实验结果:第一部分阐明NF-κB通路对气道上皮EMT过程的调控机制1.HBE细胞经TGFβ1刺激后,细胞形态不规则,肥大且成梭形,为成纤维细胞的纺锤体样特征,且大量细胞游离;NF-κB siRNA干扰后细胞形态较规则,上皮细胞形态明显,仅部分细胞形态呈成纤维样细胞。2.TGFβ1刺激后,HBE细胞的骨架蛋白(F-actin)及间质细胞表型蛋白Vimentin表达显著升高(p<0.05),上皮细胞表型蛋白E-cadherin表达显著降低(p<0.05);而给予NF-κB siRNA干扰后,HBE细胞EMT过程显著被抑制(p<0.05)。3.TGFβ1刺激后,Snail、Vimentin、NF-κB mRNA和蛋白表达显著升高(p<0.05),E-cadherin显著降低(p<0.05);而给予NF-κB siRNA处理后,Snail、Vimentin、NF-κB mRNA和蛋白表达显著减少(p<0.05),E-cadherin表达显著增加(p<0.05)。第二部分探讨BRD4通过NF-κB通路调控EMT参与哮喘气道重塑过程中的作用1.HBE细胞经TGFβ1刺激后,细胞肥大成梭形,为成纤维细胞的纺锤体样特征;给予BRD4 siRNA干扰或JQ1后,多数HBE细胞具有上皮细胞形态,少量细胞形态呈成纤维细胞样。2.HBE细胞经TGFβ1刺激后,F-actin及间质细胞表型蛋白Snail、Vimentin表达显著升高(p<0.05),上皮细胞表型蛋白E-cadherin表达显著降低(p<0.05);而给予BRD4 siRNA干扰或JQ1,F-actin及间质细胞表型蛋白Snail、Vimentin表达显著减少(p<0.05),上皮细胞表型蛋白E-cadherin表达显著增加(p<0.05)。3.HBE细胞经TGFβ1刺激后,Snail、Vimentin、NF-κB mRNA和蛋白水平表达显著升高(p<0.05),E-cadherin表达水平显著降低(p<0.05);转染BRD4siRNA或予以JQ1处理后,Snail、Vimentin、NF-κB mRNA和蛋白表达水平显著减少(p<0.05),E-cadherin表达水平显著增加(p<0.05)。实验结论:研究结果表明,NF-κB信号通路参与调控气道上皮细胞EMT过程,且受BRD4正性调控。BRD4可能作为NF-κB信号通路调控气道上皮细胞EMT的关键靶点之一,在哮喘的防治中起着靶向治疗作用,从而成为哮喘的新治疗方法和手段。