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铝(Aluminum,Al)毒是酸性土壤上抑制植物生长发育、造成作物产量下降的主要因素之一。植物响应Al毒的生理策略包括外部排斥机制和内部忍耐机制,前者公认的主要机制是Al诱导的有机酸分泌,而细胞壁的修饰作用则被认为是植物获得耐Al性的另一个决定因素,但这些过程在信号转导水平上如何被调控还知之甚少。我们期望从Al的上游信号感知和下游信号转导两个层面来阐释植物如何响应Al毒信号并启动这些抗Al机制,因此本论文重点关注处于Al信号转导途径上游的类受体激酶(Receptor-Like Kinases,RLKs)和处于下游的转录因子(Transcription Factors,TFs)。一方面,我们通过突变体Al敏感性筛选从300多个RLK T-DNA插入突变体中找到对Al表现超敏感的突变体rlkx;另一方面,我们课题组前期研究Al敏感转录因子突变体wrky47,发现其可能与细胞壁的修饰和Al的亚细胞分布有关。因此,本论文主要围绕RLKx和WRKY47这两个基因,在遗传、生理、生化和分子等水平深入研究其功能,从而解析植物抗Al信号转导的分子机制。下面是本文主要的研究结果:1.植物类受体激酶RLKx参与抗Al途径平板表型实验显示,拟南芥突变体rlkx株系表现出Al超敏感的表型,过表达35Spro:RLKx(RLKxOE)株系则明显比WT更耐Al。接下来,我们检测各株系的根系总Al含量以及Al的亚细胞分布,发现与WT相比,突变体rlkx根系的总Al含量、质外体和共质体的Al含量均显著提高,而过表达株系则降低,这意味着RLKx可能和Al的外部排斥机制有关。突变体rlkx基因ALMT1和MATE的表达量以及它们分别调控的有机酸分泌,相较于WT明显下调,而过表达株系均上调。这些数据表明RLKx可能通过调控有机酸分泌参与Al的外部排斥机制。定量PCR和GUS染色显示RLKx在转录水平上不响应Al,但RLKx的配体(一种植物多肽)基因P1明显在低pH和Al处理诱导下表达。外源添加P1在一定程度上能够提高WT的抗Al性,但无法提高rlkx的抗Al性,表明P1可能参与抗Al途径。同时,我们构建了35Spro:P1(P1-OE)过表达株系,发现与WT相比,P1-OE株系抗Al性更强,但P1过表达无法提高突变体rlkx的抗Al性,暗示P1主要通过RLKx参与拟南芥抗Al。与此结果相一致,P1过表达可以显著降低WT背景下的根系总Al含量,但无法明显降低rlkx背景下的Al含量。这些数据表明植物多肽P1通过RLKx促进Al诱导的有机酸分泌,从而参与抗Al性。由于Al诱导的有机酸分泌主要受转录因子STOP1调控,我们进一步分析了P1-RLKx信号组件与STOP1的关系。本文在RLKx和STOP1,P1和STOP1之间直接进行遗传学分析。首先,RLKxOE过表达株系耐Al,stop1突变体对Al超敏感,而RLKxOE/stop1杂交株系表现出和stop1相似的表型,表明STOP1在RLKx的下游。并且,rlkx和stop1双突变体的Al敏感性表型与单突变体类似,这意味着RLKx和STOP1位于一个信号通路。同样地,P1-OE过表达株系和stop1突变体的杂交株系也和stop1有相似的表型,暗示STOP1作用于P1的下游。定量PCR和有机酸分泌检测的结果显示P1-RLKx促进ALMT1和MATE的表达以及有机酸的分泌依赖于STOP1。由于STOP1在转录水平上不响应Al,但其蛋白水平受Al的快速诱导,因此我们进一步检测了P1-RLKx对STOP1蛋白水平的影响。利用35Spro:STOP1-GFP转基因株系,我们发现在Al处理条件下,突变体rlkx细胞核中的STOP1-GFP蛋白累积明显低于WT,而RLKx和P1过表达则显著增加其蛋白积累。酵母双杂交结果进一步显示,RLKx与STOP1不存在直接互作,暗示P1-RLKx间接调控STOP1蛋白的累积。上述结果表明P1-RLKx主要通过调控STOP1蛋白在细胞核中的积累来参与植物抗Al性。2.WRKY47通过调节细胞壁修饰调控植物耐Al性在课题组前期研究中,我们发现了转录因子WRKY47和根系生长及耐Al性有关。突变体wrky47对Al胁迫非常敏感,而其过表达株系的耐Al性明显增强。我们证实WRKY47功能的缺失显著影响根系在Al胁迫下对Al的亚细胞分配,具体表现为共质体Al含量增多而质外体Al含量减少。这是因为突变体细胞壁中半纤维素I的含量减少,导致其固定Al的能力降低。通过基因芯片技术、RT-qPCR和ChIP实验分析,本文进一步表明WRKY47直接调控负责细胞壁修饰的基因EXTENSIN-LIKE PROTEIN(ELP)和XYLOGLUCAN ENDOTRANSGLUCOSYLASE-HYDROLASES17(XTH17)的表达,而ELP和XTH17表达量的提高部分回复了wrky47突变体根伸长缺陷和Al敏感的表型。上述结果证明,在正常和Al胁迫生长条件下,WRKY47通过调控细胞壁修饰基因的表达调节根系的生长。同时,WRKY47维持Al在共质体和质外体的分配平衡对于植物获得耐Al性非常重要。