【摘 要】
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背景雄激素缺乏日渐成为影响男性健康的重大问题。传统激素替代疗法存在诸多弊端。诱导干细胞向Leydig样细胞分化并用于移植治疗效果较好,但干细胞来源少,诱导效率低下限制了
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背景雄激素缺乏日渐成为影响男性健康的重大问题。传统激素替代疗法存在诸多弊端。诱导干细胞向Leydig样细胞分化并用于移植治疗效果较好,但干细胞来源少,诱导效率低下限制了其应用。使用重编程方法使成纤维细胞体外转化为具有睾酮分泌功能的Leydig样细胞有望成为新的治疗手段。目的探讨使用重编程方法使儿童包皮成纤维细胞体外转化为具有睾酮分泌功能的Leydig样细胞的可行性。方法使用酶消化法从儿童包皮中获取成纤维细胞。用GFP标记的慢病毒感染法将Leydig细胞发育过程中的4个关键转录因子(GATA4,SF-1,NGFI-B和COUP TF2)以不同组合方式转入包皮成纤维细胞。转染一周后,用流式分选法选取GFP阳性细胞继续培养;转染1周、2周、3周和4周后在m RNA水平检测成纤维细胞标志物(E-Cadherin)及Leydig细胞特异性标记物(CYP11A1、CYP17A1、HSD3B1、StAR、HSD17B3)表达情况,在蛋白水平检测CYP11A1、CYP17A1、HSD3B1表达水平来判断细胞转化效率;收集转染1周、2周、3周、4周后细胞培养液,化学发光法检测培养液中睾酮水平。结果qRT-PCR结果表明,与空载组相比,实验组Leydig细胞特异性标记物(CYP11A1、CYP17A1、HSD3B1、StAR以及HSD17B3)显著升高(P<0.05),但成纤维细胞标志物表达无统计学差异(P>0.05),和免疫荧光结果保持一致。Western blotting显示转染3周、4周后实验组CYP11A1、CYP17A1表达量高于空载组但有下降趋势。实验组细胞在转染3天后开始分泌睾酮,在第12天分泌量达到高峰3.69 ng/ml(P<0.05),最终在转染4周后下降至0.147ng/ml(P<0.05)。此外,qRT-PCR结果显示GATA4和SF-1对于Leydig细胞特异性标记物的表达起关键作用,同时GATA4,SF-1和NGFI-B三种转录因子组合即可以生成具有睾酮分泌能力的诱导型Leydig样细胞。结论通过慢病毒感染法使包皮成纤维细胞高表达GATA4,SF-1,NGFI-B 3种转录因子可以在体外成功将成纤维细胞重编程为有睾酮分泌功能的Leydig样细胞,并有望为雄激素缺乏提供新的治疗方法。
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