背景:Oddi括约肌(sphincter of Oddi, SO)是胆总管、胰管与十二指肠间重要的解剖结构,在维护胆管内流体环境的稳定和调节胆管胆汁流动中起着关键作用。胆囊胆汁淤积是胆囊胆固醇结石形成的动力学基础,而胆囊成石前是否淤胆与SO的功能状态密切相关。我们的前期研究证实,高胆固醇血症(hypercholesterolemia, HC)可诱发兔胆囊淤胆并形成结石,这与SO细胞的外向的电压依赖性钾离子通道(voltage-dependent potassium channel, Kv)和大电导钙激活型钾离子通道(large conductance, calcium-activated potassium channel, BKca)的电流密度减小导致的细胞内钙离子浓度(intracellular calcium concentration, [Ca2+]i)超载,进而诱发的SO功能紊乱(sphincter of Oddi dysfunction, SOD)密切相关。但是HC影响Kv和BKca通道活性的机制不清。Kv1.5和BKca通道是L型电压依赖性钙离子通道(L-type voltage-dependent calcium channel, L-VDCC)的重要上游调控通道,伴随着外向钾离子电流的变化,细胞膜电位发生改变,L-VDCC的功能状态亦发生相应变化,进而影响[Ca2+]i而调节平滑肌张力。影响钾离子通道活性的因素众多,除了通道蛋白的表达水平外,通道蛋白丝/苏氨酸和酪氨酸残基的磷酸化/脱磷酸化状态也是离子通道活性的重要调节因素。蛋白激酶是钾离子通道蛋白磷酸化/脱磷酸化调节的一个重要环节,分子生物学信息分析显示,BKca通道上存在多个丝/苏氨酸蛋白激酶和酪氨酸激酶的磷酸化位点。一般认为,Ⅱ型钙离子/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ, CaMKⅡ)、蛋白激酶A(cAMP-dependent protein kinase, PKA)、蛋白激酶G(cGMP-dependent protein kinase, PKG)和酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase, PTK)可增强BKca通道的活性,而蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)抑制BKca通道的活性,其中CaMKⅡ和PKC与[Ca2+]i密切相关,而我们已经证实HC兔SO细胞处于[Ca2+]i超载状态,但SO细胞[Ca2+]i超载是否与HC条件下上述激酶导致BKca通道蛋白的磷酸化/脱磷酸化变化及通道蛋白的表达变化有关并不清楚。目前认为临床上各种形式的外科手术和内镜治疗均有可能损伤SO的生理功能并诱发多种并发症,因而它们均不被认为是SOD最理想的治疗方法,寻找新的安全、简便和有效的SOD治疗方法,仍然是研究的热点和难点。积极探寻可有效治疗SOD的中西药物,改善SO的收缩舒张功能对SOD患者来说至关重要。SOD的发病基础是SO细胞Kv和BKca通道活性的下降,这与高血压和低氧性肺动脉高压等疾病有相似之处。丹参酮ⅡA磺酸钠(tanshinoneⅡA sulphonate, STS)是丹参提取物的水溶性衍生物,基于它对血管平滑肌细胞离子通道的影响而产生的舒张作用,目前临床上已应用于治疗高血压等血管张力异常性疾病,但其能否对SOD产生有益的缓解作用未见报道。方法和目的:本课题通过喂饲含胆固醇饲料12周,复制HC的兔模型,(1)采用反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)和免疫印迹法检测兔SO细胞Kv1.5和BKca通道的mRNA和蛋白表达表达量;(2)采用免疫沉淀和免疫印迹相结合的方法,检测HC兔SO细胞BKca通道蛋白苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸残基的磷酸化水平;(3)采用免疫印迹方法检测与[Ca2+]i相关的钙调蛋白(calmodulin, CaM)、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ的表达,并采用放射性方法检测CaMKⅡ和PKC的活性;(5)采用药物干预和离体肌环张力实验,检测BKca通道蛋白酪氨酸残基的磷酸化/脱磷酸化状态与SO肌张力调节的关系,并探讨STS对HC诱导的SOD的作用及其可能的调控位点,以阐明HC兔SO细胞Kv和BKca通道活性降低的调节机制和探讨STS治疗HC诱导的兔SOD的可能机制,为早期干预SOD提供实验和理论基础。结果:(1)通过喂饲12周的胆固醇饲料,HC组新西兰兔的血清总胆固醇浓度远大于10 mmol/L,说明实验中成功建立了新西兰兔的高胆固醇血症模型。(2)HC明显降低兔SO细胞Kv1.5通道的mRNA和蛋白表达水平,但BKca通道α和β1亚基的mRNA和蛋白的表达无明显变化。(3)HC兔SO细胞BKca通道蛋白的磷酸化水平发生异常改变:α亚基苏氨酸和酪氨酸残基的磷酸化水平明显降低,丝氨酸残基的磷酸化水平明显增加。β1亚基的苏氨酸残基的磷酸化水平无明显改变。(4)HC兔SO细胞CaM的蛋白表达无明显改变,CaMKⅡ的活性却明显增加。(5)HC兔SO细胞的PKC活性增加,这可能是BKca通道α亚基丝氨酸残基的磷酸化水平升高的原因。(6)相对于CON组,HC组SO肌环对不同浓度的乙酰胆碱(acetylcholine, Ach)的反应性显著升高;30μmol/L NS1619(BKca通道的激动剂)可部分缓解HC组的高反应性。而10-5 mol/L Genistein(PTK的抑制剂)使Ach预收缩HC组SO肌环的量—效曲线左移,加重HC组SO肌环的高反应性,并且这个效应可被NS1619逆转;而10-4 mol/L Na3VO4(蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制剂)则使Ach预收缩HC组SO肌环的量—效曲线右移,减轻HC组肌环的高反应性;当Na3VO4和NS1619协同作用,进一步减轻了HC组SO肌环的高反应性。(7)不同浓度的STS对HC兔SO肌环产生剂量依赖性的的舒张作用,这种舒张作用可以被200 nmol/L的BKca通道的特异性阻滞剂IbTX所抑制,但Kv通道的阻滞剂4-AP无此作用。结论:(1)Kv1.5通道的表达降低和BKca通道的磷酸化水平的改变是HC兔SO细胞外向钾电流减小的原因。这是HC诱发兔SO细胞[Ca2+]i超载和SOD发生的重要原因。(2 ) HC兔SO细胞PKC的活性增加可能是BKca通道丝氨酸残基磷酸化水平增加的原因。(3)BKca通道是高胆固醇血症兔SO高反应性的一个重要因素;与PTK或PTP相关的BKca通道蛋白的酪氨酸残基的磷酸化水平变化,至少是HC条件下SO细胞钙离子超载和SO张力升高的重要机制之一。(4)STS对HC兔SO肌环的舒张作用可能与其激活SO细胞的BKca通道有关。这为SOD的治疗提供了新的切入方向和实验基础。