木质素是含有氧代苯丙醇或其衍生物结构单元的芳香性天然有机高分子化合物,是世界上储量仅次于纤维素含量的有机生物质。木质素可再生,虽能大量提供可再生芳基化合物,但难于生物降解,限制了木质素的应用前景和价值。木质素生物降解在自然界有机碳素的生物地球化学循环中起关键作用,是决定碳循环的限速步骤。愈创木基结构(又称木质素G单元)是木质素中唯一一种在所有木素质中都普遍存在的通用构成单元,它的降解机制基本上代表了所有木质素的降解途径,研究G单元的生物降解对木质素的降解具有非常重要的现实意义,也对木质素来源的芳香族化合物(如造纸厂黑液)污染治理有着重要的作用。其中,木质素G单元系列化合物中代表化合物阿魏酸及其结构类似物羟基肉桂酸具有普遍研究关注度。因此,本研究以阿魏酸及其结构类似物为底物,研究劳尔氏菌对其的生物降解。劳尔氏菌是一种革兰氏阴性细菌,可破坏植物细胞壁组织进入木质部导管而致病,因而可能降解木质素成分。根据劳尔氏菌基因组信息,我们发现其rsp0221-rsp0228基因可能和阿魏酸的降解相关,rsp021为二组分反应调节子,在劳尔氏菌对外界反应过程中起作用；rsp022和rsp0223编码○型香草酸脱甲基酶和○型脱甲基氧亚基氧化还原酶,负责将香草酸降解到原儿茶酸；rsp0225编码肉桂酰辅酶A水解酶,负责肉桂酰辅酶A的脱氢反应,生成醛类物质；rsp0226编码醛脱氢酶,将醛代谢到酸；rsp0227基因编码肉桂酰辅酶A合成酶,负责对羟基肉桂酸的酰化；另外,Rsc1285可能影响Ⅲ型分泌系统对植物导管的侵入。因此,本研究通过基因敲除和功能互补等技术构建上述相关基因突变体,研究其对木质素G单元(阿魏酸等)的生物降解及相关基因的功能作用。本研究成功构建了劳尔氏菌rsp0221基因和rsp0227基因缺失的突变菌株。研究发现,高浓度的阿魏酸对劳尔氏菌的生长有明显抑制作用,而0.5g/L阿魏酸的添加对劳尔氏菌生长没有影响,且在该浓度范围下,劳尔氏菌可利用阿魏酸为唯一碳源生长。rsp0227基因缺失,使得其无法利用羟基肉桂酸为唯一碳源生长,但可利用羟基肉桂酸代谢下游产物为唯一碳源生长,rsp0227基因互补菌株可以把rsp0227基因缺失突变体利用羟基肉桂酸为唯一碳源生长的能力恢复到野生型水平。表明Rsp0227负责劳尔氏菌对羟基肉桂酸的直接降解,即负责肉桂酰辅酶A的合成。rsp0221基因的缺失,并不影响劳尔氏菌利用羟基肉桂酸为唯一碳源的生长,表明Rsp0221可能和羟基肉桂酸的降解不直接相关。在对阿魏酸降解时,劳尔氏菌野生型和rsp0221基因缺失突变体在1天后可降解高达90%的阿魏酸,而rsp0227基因缺失突变体丧失了对阿魏酸的降解能力。此外,劳尔氏菌的Ⅲ型分泌系统在其侵入植物导管的过程中起主要作用,能将一些效应蛋白注入到植物细胞内。因此,我们研究了阿魏酸对Ⅲ型分泌系统表达的影响。结果发现,阿魏酸的添加明显促进了劳尔氏菌野生型、rsp0221、rsp0227基因缺失突变体中Ⅲ型分泌系统基因的表达水平(提高2-3倍),表明阿魏酸可能促进了劳尔氏菌对植物细胞破坏、侵入过程。当rsc1285基因缺失时,劳尔氏菌Ⅲ型分泌系统的表达水平明显降低了1/2,而rsc1285基因互补可以把其Ⅲ型分泌系统的表达水平恢复到野生型表达水平,表明Rscl285是影响劳尔氏菌Ⅲ型分泌系统表达的一个因子。劳尔氏菌Ⅲ型分泌系统受到HrpB的直接控制,而hrpB的表达受到HrpG、PrhG的共同调控。本研究发现,Rsc1285通过HrpB控制Ⅲ型分泌系统基因的表达,但和HrpB上游调控因子HrpG、PrhG无关。在侵染番茄植株时,rsc1285基因缺失突变体在宿主体内(木质部导管)展现出与野生型相同的生长能力,表明Rscl285在劳尔氏菌对植物导管的侵染过程中并无大的影响,其具体功能仍有待于进一步研究。