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目的近几年国内外关于P糖蛋白与血糖稳态相关性的研究越来越多,但目前其对胰岛素分泌的影响及相关分子机制尚不明确。脂筏是质膜上富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域,它在细胞信号转导过程中起着关键性作用,P糖蛋白作为脂筏结构域众多跨膜蛋白中的一员,其与脂筏相关蛋白间的关系尚不清楚。因此,本研究旨在探讨P糖蛋白过表达对胰岛β细胞胰岛素分泌的影响,并初步阐明相关分子机制-以P糖蛋白为靶点的脂筏相关蛋白间的相互作用。方法为验证上述假设,本课题将从组织和细胞水平展开以下实验研究:（1）实验对象为大鼠胰岛素瘤细胞株INS-1 832/13细胞（以下简称832/13细胞）和手工摘取的正常大鼠胰岛组织。（2）优化腺病毒感染条件:成功构建过表达P糖蛋白的腺病毒,分别用空白对照腺病毒（Ad-Control）和不同滴度（5.0×106,10×106,50×106,100×106pfu/mL）过表达P糖蛋白的腺病毒（Ad-Abcb1b）感染细胞24h,作滴度效应曲线;用滴度为50×106pfu/mL的空白对照腺病毒和过表达P糖蛋白的腺病毒分别感染细胞12h,24h和48h,作时间效应曲线;通过荧光显微镜观察腺病毒感染的荧光效果;用MTT法检测P糖蛋白过表达对细胞的毒性作用;用罗丹明123荧光实验测定P糖蛋白外排泵功能的变化。（3）用实时定量PCR法检测P糖蛋白mRNA基因和胰岛素基因（pdx1,ins1以及ins2）表达的变化。（4）用Western blot技术检测相关蛋白表达的变化:P糖蛋白,凋亡相关蛋白（Cleved-caspase3的水解及Bcl2的表达）,磷酸化AMPK、PKA及CREB,脂筏相关蛋白,包括小窝蛋白1（caveolin-1,Cav-1）、L型钙离子通道蛋白1.2（L-type calcium channel protein,Cav1.2）、钾离子通道蛋白6.2（Kir6.2）以及腺苷酸环化酶8（adenylate cyclase8,AC8）。（5）通过ELISA方法测定细胞内cAMP含量和高糖孵育后胰岛素分泌量。（6）通过免疫共沉淀法检测脂筏相关蛋白（P-gp、Caveolin-1、Kir6.2以及AC8）之间的相互作用。（7）通过激光共聚焦技术测定细胞内钙信号变化。结果（1）与阴性对照组（Ad-Control）相比,MTT测定结果表明P糖蛋白过表达（Ad-Abcb1b）并未对INS-1 832/13细胞产生明显的毒性作用（p>0.05）;PCR和Western blot探测结果分别显示P糖蛋白过表达组abcb1b的mRNA表达量和P糖蛋白的蛋白表达量在细胞和胰岛组织上均明显增加（P<0.01）,且细胞胞膜上P糖蛋白表达量也增加;罗丹明123荧光实验结果显示Ad-Abcb1b组细胞内罗丹明123积累显著降低（P<0.01）,表明P糖蛋白外排泵功能增强;以上结果均提示P糖蛋白过表达构建成功。（2）Western Blot结果显示:Bcl2的表达和Cleved-caspase3的水解情况均未产生显著变化（P>0.05）,提示P糖蛋白影响胰岛素分泌可能与凋亡途径无关。（3）实时定量PCR结果显示胰岛素基因pdx1,ins1以及ins2表达量没有发生显著变化（p>0.05）,提示P糖蛋白过表达并不影响胰岛素合成;高糖刺激后胰岛素分泌实验结果表明:与阴性对照组相比,2.5mM浓度的葡萄糖孵育细胞（胰岛组织）后,Ad-Abcb1b组胰岛素含量和基础胰岛素分泌量未产生显著变化（p>0.05）;当16.7mM葡萄糖刺激后,Ad-Abcb1b组细胞（胰岛组织）的胰岛素分泌量明显增加（p<0.05）,提示P糖蛋白对基础胰岛素分泌没有影响,但能够促进高糖刺激的胰岛素分泌。（4）与阴性对照组相比,Kir6.2表达未发生明显变化（P>0.05）,而Cav-1、Cav1.2表达量均明显增加,差异有统计学意义（P<0.05）,且胞膜上Cav1.2表达量也明显增加（结果未显示）;提示P糖蛋白调控胰岛素分泌可能与Cav1.2的胞膜转运有关。（5）免疫共沉淀结果显示P-gp与Cav-1,Cav-1与Kir6.2,Cav-1与AC8具有相互作用关系,提示提示P糖蛋白影响胰岛素分泌的相关机制可能与“脂筏”稳定性相关。（6）与阴性对照组相比,Ad-Abcb1b组AC8表达量增加,细胞内cAMP含量明显增加（P<0.01）;AMPK活性降低（P<0.05）,PKA、CREB活性增加（P<0.05）,P糖蛋白调控胰岛素分泌可能与激活cAMP-PKA-CREB信号通路进而促进胞膜Cav1.2转运有关。（7）激光共聚焦技术测定结果显示:高糖刺激后,Ad-Abcb1b组细胞内钙离子浓度较阴性对照组明显增加（p<0.05）,进一步验证了上述实验结果,提示P糖蛋白调控胰岛素分泌可能与钙离子通道有关。结论P糖蛋白过表达可能不是通过对细胞凋亡的抑制作用和增加胰岛素生物合成发挥促胰岛素分泌的作用,而可能是由于通过脂筏的稳定性促进Cav1.2胞膜转运以及激活cAMP-PKA-CREB-Ca2+1.2信号通路,具体机制有待于进一步证明。