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研究背景组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylases,HDACs)是维持染色体的基本组成单位核小体的蛋白乙酰化和去乙酰化平衡的关键酶类之一,HDACs催化组蛋白的去乙酰化作用与基因转录抑制密切相关,牵涉到基因沉默等诸多过程[1-2]。根据文献报导,HDAC家族Class IIa成员HDAC4参与1型干扰素(Type1-Interferon)信号通路的调控,但HDAC4具体如何参与宿主抗HSV-1病毒反应,其参与调控天然免疫的机制仍然不甚清楚。本研究发现单纯疱疹病毒HSV-1感染敲除HDAC4基因的人喉鳞癌细胞(HEp-2)复制能力显著变弱,在诸多宿主抗病毒感染的天然免疫机制中,双链RNA依赖性蛋白激酶(protein kinase regulated by double stranded RNA-PKR)可以识别来自病毒的RNA并自磷酸化,磷酸化的PKR可以通过磷酸化宿主转录起始因子(e IF2α)关闭蛋白的合成[3-5],是宿主抗HSV-1感染的重要机制。HSV-1感染HDAC4敲除的HEp-2细胞时复制能力的变弱可能与PKR信号通路密切相关,本研究将着重探讨HDAC4与PKR的关系,及其对单纯疱疹病毒HSV-1复制能力的影响。目的本研究旨在通过基因敲除或敲减的方法研究HDAC4对宿主抗HSV-1病毒的天然免疫通路的影响,为寻找抗病毒感染药物研发新靶点提供科学理论依据。方法1.利用si RNA干扰技术敲减HDAC1/4表达,Western Blot和病毒滴度实验研究HDAC1/4对PKR通路的影响及对病毒蛋白表达和病毒生长的影响。2.采用转染过表达质粒技术过表达HDAC1/4,Western Blot和病毒滴度实验研究HDAC1/4对PKR通路的影响及对病毒蛋白表达和病毒生长的影响。3.使用CRISPR/Cas9敲除技术,敲除目的基因构建稳定表型的细胞系。4.使用q PCR和、Western Blot和病毒滴度测定实验等方法,研究HDAC1/4敲除对天然免疫通路的影响及对病毒蛋白表达和病毒生长的影响。结果1.人喉鳞癌细胞(HEp-2)中HDAC4的敲减和敲除都能显著抑制单纯疱疹病毒(HSV-1)的复制。2.HSV-1感染人喉鳞癌细胞(HEp-2)时磷酸化PKR(P-PKR)随时间增加而增加;在HDAC4-KO细胞系中感染HSV-1后,相较于母本HEp-2细胞中,P-PKR升高更显著。3.在HEp-2中敲减HDAC4后感染HSV-1可以上调P-PKR水平,并抑制HSV-1的复制,相应在HDAC4-KO细胞系中恢复HDAC4的表达可以下调P-PKR,并部分恢复病毒复制能力。4.在HEp-2中敲减HDAC1或在敲除细胞系中过表达HDAC1后对P-PKR的水平影响不明显,对病毒复制的影响也不如HDAC4明显。5.病毒感染HDAC4敲除细胞系后会引起MDA5,PKR,RIG-I,MAPK3,GADD34 m RNA表达水平升高,但在HDAC4-KO细胞系中si RNA敲减这些高表达的基因并不能恢复病毒的复制能力。结论1.HDAC家族Class IIa成员HDAC4的表达对HSV-1的复制有重要影响。2.HDAC4蛋白的表达与P-PKR蛋白水平呈负相关,在缺失HDAC4蛋白表达的情况下,P-PKR会显著升高,证明HDAC4在调控PKR磷酸化修饰过程中起重要作用。3.HDAC4基因的敲除会引起一系列天然免疫基因的表达上调,将这些上调的基因用si RNA进行敲减并不能恢复HSV-1的复制能力,说明HDAC4可能是处于天然免疫基因网络的上游,敲减其中某个因子并不能恢复HDAC4缺失带来的影响;或者HDAC4只是间接影响了天然免疫基因网络,敲减基因并不能影响HDAC4缺失带来的影响。