论文部分内容阅读
金属硫蛋白（metallothionein,MT）是一类普遍存在于生物体且富含半胱氨酸（Cys）的一类低分子量蛋白,已在包括原核生物、植物、无脊椎动物和脊椎动物等多种生物中分离并被研究应用。通过其半胱氨酸硫醇基团与重金属具有结合能力,在金属稳态和重金属毒性、DNA损伤、氧化应激、拮抗电离辐射等保护中起重要作用,并为其他金属蛋白和金属酶类提供活性中心,在营养保健、医药、生物工程、养殖及环境监测保护方面有着广泛的应用。本研究以口虾蛄（Oratosquilla oratoria）为原料,进行MT的提取与纯化制备工艺研究,一方面为海洋生物资源的开发和利用提供新的思路,另一方面也为后续开展口虾蛄体内重金属元素富集机理研究打下基础。研究内容如下:1.为高效利用口虾蛄制备MT,以口虾蛄MT提取量为指标,考察液料比、Tris-HCl提取液浓度、提取温度、提取液pH、提取时间等因素对MT提取效果的影响。采用单因素试验结合响应面分析法优化试验条件,得到了口虾蛄MT的最佳提取工艺:液料比为4,Tris-HCl提取液浓度为0.02 mol/L,提取温度为51℃,提取液pH为7.8,提取时间1 h;此条件下口虾蛄MT最大提取量为0.232 mg/g,该结果与理论预测值基本相符。2.利用Sephadex G-50凝胶柱和DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱对粗蛋白进行分离纯化,获得了口虾蛄MT的分离与纯化制备条件。Sephadex G-50洗脱条件为:0.02 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）洗脱、流速0.8 mL/min、8 mL/管,洗脱体积450 mL;DEAE Sepharose Fast Flow洗脱条件为:先用0.02 mol/L Tris-HCl（pH8.6）结合0.02 mol/L Tris-HCl+0.5 mol/L NaCl（pH 8.6）溶液进行洗脱、0.8 mL/min、8 mL/管,洗脱体积500 mL。220 nm下紫外比色同时结合ICP-MS测定金属元素信号进行对比确认。分离物再经Sephadex G-25脱盐得到高纯度的口虾蛄MT-1、MT-2。MT-1经高效液相凝胶过滤色谱法和Tricine-SDS-PAGE电泳测定,其分子量约为15 KDa。由高效液相色谱-荧光检测法和高效液相分子排阻色谱-紫外检测法测定,根据面积归一法计算目标物出峰面积,得到口虾蛄MT-1的纯度大约在91.50%。3.对分离纯化的高纯度口虾蛄MT物进行Cu、Zn等金属元素结合量、等电点、氨基酸组成和纯度测定,再使用紫外光谱法、红外光谱法、圆二色谱法等对纯化产物进行结构表征。结果显示:口虾蛄MT-1主要是以Zn-MT的形式存在,另外还结合了较多的Cu;MT-1的等电点（pI）为4.1;口虾蛄MT中半胱氨酸（Cys）占总氨基酸的32.44%,不含芳香族氨基酸;经紫外光谱分析,口虾蛄MT-1溶液在270 nm左右处有明显的吸收峰,在280 nm处没有吸收峰,加入EDTA处理后270nm处吸收峰消失;红外光谱分析表明口虾蛄MT的吸收带均对应着I型无规则卷曲构型,其中MT-1与MT-2的酰胺带I位分别位于1640.92 cm-1处和1642.03 cm-1处,主要由酰胺C=O强伸缩振动引起、并伴有NH弯曲振动（剪式）;而酰胺带II依次位于1537.32 cm-1处和1539.50 cm-1处,由NH弯曲振动与C-N中度伸缩振动引起,酰胺带III均不太明显,但伴有C-N中度伸缩振动峰;圆二色谱（CD）分析显示口虾蛄MT-1、MT-2的二级结构主要为无规则卷曲构像,伴有一定的β-折叠,且口虾蛄MT-1、MT-2的二级结构较为接近,这与红外光谱分析结果一致。抗氧化活性初步评价试验显示:DPPH自由基的清除能力大小顺序依次为兔肝MT-1>兔肝MT-2>口虾蛄MT-1>口虾蛄MT-2>VC。综上,本研究不仅为金属硫蛋白的制备提供了新的技术路线,也为揭示口虾蛄重金属富集机理提供了基础。