论文部分内容阅读
目的: 近年来由于大量使用碳青霉烯类抗菌药物，使该类药物对产ESBLS和头孢菌素酶的肠杆菌科细菌的抗菌活性下降，而肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药性则明显增强。 本研究拟分析碳青霉烯类药物非敏感肠杆菌科细菌的表型和基因型，探讨该类细菌的流行情况和耐药机制，为临床合理使用抗菌药物和减少院内感染提供依据。 方法: 1.收集2010年1月至2013年10月，来自临床标本的碳青霉烯类药物非敏感肠杆菌科细菌125株，纸片扩散法检测细菌的敏感性，改良Hodge试验(MHT)检测碳青霉烯酶的表型，纸片扩散表型确证试验检测超广谱β-内酰胺酶(ESBLS)。 2.PCR扩增后的产物经DNA测序后，通过BLAST比对等方法确定收集的125株菌株中携带的碳青霉烯酶、质粒介导的AmpC酶和超广谱β-内酰胺酶的耐药基因型。 3.脉冲场凝胶电泳技术对收集到的125株菌株进行同源性分析。 4.随机挑选30株已经检测出含blaKPC-2耐药基因的菌株，用碱裂解法提取质粒，PCR扩增编码KPC-2的基因，构建表达载体pEASY-T1-KPC-2，并转化至感受态细胞，转化子经PCR后测序，以确认构建和转化是否成功，并对测序成功的转化菌株做药敏试验。 结果: 1.药敏试验结果125株碳青霉烯类药物非敏感肠杆菌科细菌对头孢噻肟和阿莫西林/克拉维酸耐药率最高，均为93.6％;对环丙沙星、复方新诺明、四环素、头孢他啶、头孢西丁、氨曲南、亚胺培南和厄他培南的耐药率在64.0％～89.6％之间;对阿米卡星、妥布霉素、呋喃妥因和头孢吡肟耐药率相对较低，为14.4％～38.4％;对替甲环素和米诺环素敏感率高，分别为88.0％和84.0％，检出11株对替甲环素中介株和4株耐药株，其中对替甲环素耐药细菌分别为2株粘质沙雷菌和2株产气肠杆菌。 2.改良Hodge试验及ESBLS表型试验结果125株碳青霉烯类药物非敏感肠杆菌科细菌中，共检出产碳青霉烯酶细菌(Hodge试验阳性)为89株，占71.2％，其中大肠埃希菌为主要检出菌有58株，占65.2％(58/89)，其次是阴沟肠杆菌15株，占16.9％(15/89)，粘质沙雷菌7株，占7.9％(7/89)，产气肠杆菌6株，占6.7％(6/89)。产ESBLS的细菌为42株，占33.6％。同时产这两种酶的细菌为23株，占18.4％。 3.耐药酶基因检测及序列测定结果125株碳青霉烯类药物非敏感肠杆菌科细菌中，分别有42(33.6％)、5(4.0％)和1(0.8％)株细菌检出blaKPC-2、blaIMP-26和blaVIM-2等碳青霉烯酶基因;分别有18(14.4％)、9(7.2％)和2(1.6％)株细菌检出blaCTX-M-15、 blaSHV-12和blaCTX-M-3等ESBLS基因;分别有19(15.2％)和13(10.4％)株细菌检出b laACT-1和blaCMV-2等AmpC酶基因。其中71株大肠埃希菌中检出39(54.9％)株菌携带blaKPC-2基因，分别有17(23.9％)和3(4.2％)株携带blaCTX-M-15和blaSHV-12基因，分别有12(16.9％)和2(2.8％)株携带blaCMY-2和blaACT-1基因。20株阴沟肠杆菌中分别检出5(25.0％)和1(5.0％)株菌携带blaIMP-26和blaVIM-2基因，分别有5(25.0％)和2(10.0％)株菌携带blaSHV-12和blaCTX-M-3基因，有17(85.0％)株携带blaACT-1基因。17株产气肠杆菌检出blaKPC-2和blaSHV-12基因阳性各1株;12株黏质沙雷菌中检出1株blaKPC-2基因阳性。1株柠檬酸杆菌检出 blaKPC-2和blaCMY-2基因阳性，另1株柠檬酸杆菌检出blaCTX-M-15基因阳性。未检出GES、IMI、GIM、SPM、SIM、NDM-1和OXA等其他基因型。2株摩根摩根菌和1株奇异变形杆菌中未检出碳青霉烯酶和ESBLS等基因。 4.脉冲场凝胶电泳(PFGE)将125株菌株分为8个谱型，19个亚型。其中以A型为主，共有57株，占45.6％(57/125)，其次为D型有18株，占14.4％(18/125)，再者为B型有15株，占12.0％(15/125)。 5.转化试验及药敏结果 PCR结果显示，随机挑选的阳性菌落均含重组质粒，测序验证30株转化菌株pEASY-T1-KPC-2载体构建和转化全部成功。随机选取10株pEASY-T1-KPC-2载体构建和转化成功的菌株经过纸片扩散法药敏试验验证，8株转化菌株出现对头孢菌素类、碳青霉烯类、单环酰胺类以及β-内酰胺类联合酶抑制剂类药物耐药，另外2株对这些药物敏感。3株子代菌株与原代转化菌株的药敏结果一致。 结论: 1.碳青霉烯类药物非敏感肠杆菌科细菌对所检测的β-内酰胺类药物呈现多重耐药，米诺环素和替甲环素敏感率高，临床可考虑使用这两种药物进行临床感染治疗。 2.碳青霉烯类药物非敏感肠杆菌科细菌碳青霉烯酶基因以blaKPC-2为主，主要存在于大肠埃希菌。其次为blaIMP-26和blaVIM-2基因，主要存在于阴沟肠杆菌。ESBLS基因以blaCTX-M-15为主，存在于大肠埃希菌。AmpC酶基因以blaACT-1为主，存在于阴沟肠杆菌。 3.脉冲场凝胶电泳的同源性分析显示125株细菌具有多个克隆型，以A型为主。 4.耐药基因主要通过质粒在菌株之间水平散播，这是造成菌株耐药流行的主要原因。