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近年来,口腔健康经济和颜值经济不断的升级,正畸市场渗透率也在逐步提高,但在正畸治疗过程中仍存在问题,如疗程过长、正畸后出现“黑三角”等等。正畸牙齿移动（orthodontic tooth movement,OTM）,是一个机械力诱导牙周组织改建的过程。牙齿受力后,将力信号传递至牙周组织,牙周组织细胞再将力信号转化为生化信号,调节骨重塑。骨组织细胞为机械敏感细胞,可通过细胞膜表面的机械刺激感受器接收力信号。OTM的过程中,受压侧牙槽骨中破骨细胞分化活跃,使骨吸收作用增强,而在牵张侧,张力促进成骨分化的活动更积极,使得骨形成占主导作用。许多细胞因子都参与骨改建,其中促红细胞生成素肝细胞激酶受体B4及其配体B2（erythropoietin producing hepatocyte kinase receptor and ephrin ligand,Eph B4/ephrin B2）是在成骨细胞和破骨细胞膜表面表达的配体和受体,对骨改建有调节作用,且对机械刺激敏感。因此,为了探究OTM中骨改建的分子机制,本研究以压力-张力学说中“压力侧骨吸收活跃,张力侧骨形成活跃”为理论依据,结合ephrinB2-EphB4信号在骨改建中的作用,提出了假设:ephrinB2-EphB4正向信号与正畸牵张侧骨形成活跃具有相关性。以期在细胞分子层面明确机械力诱导正畸骨改建的机制,为牙齿移动提供理论基础,为改善正畸治疗策略提供可能。第一部分:机械张力对成骨分化的影响实验目的:探究机械张力对成骨细胞增殖、分化及相关信号通路的影响。实验方法:培养小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1,使用四点弯曲细胞加力系统对MC3T3-E1分别加载1000、2000和4000με（生理性的低、中和高强度）的机械张力,刺激时间为0、2、6和12 h,模拟体外正畸加力。观察加载机械张力后细胞的形态变化,采用CCK-8法检测机械张力刺激后细胞增殖的变化。成骨诱导后,分别通过ALP活性、ALP染色、茜素红染色、q PCR和western blot方法检测机械张力刺激后MC3T3-E1中成骨分化相关因子ALP、RUNX2、OPN和OCN的表达水平;检测力刺激后MC3T3-E1中ephrinB2-EphB4、MAPKs和PI3K/Akt信号通路的变化。实验结果:显微镜下观察显示,机械张力可使MC3T3-E1的形态被拉长,细胞突触延长。CCK-8结果显示,与对照组相比,1000和2000με的机械张力对MC3T3-E1增殖无影响,4000με的力刺激显著抑制细胞增殖。ALP活性、ALP染色和茜素红染色结果显示,与对照组相比,1000和2000με的机械张力可显著促进MC3T3-E1成骨分化。因此,在后续的实验中,选择2000με作为最适强度对MC3T3-E1施加机械张力。q PCR和western blot结果显示,与对照组相比,机械张力刺激后,MC3T3-E1中成骨分化相关因子RUNX2、OPN和OCN的表达水平显著上调。相关的信号通路检测结果显示,机械张力可促进MC3T3-E1中ephrin B2配体和Eph B4受体的表达,ephrinB2-EphB4正向信号、MAPKs和PI3K/AKT通路在张力的作用下也发生了明显的活化。结论:1000和2000με的机械张力对成骨细胞的增殖无影响;1000和2000με机械张力可显著促进成骨分化。2000με的机械张力可促进成骨细胞中ephrin B2配体和Eph B4受体的表达。Ephrin B2-Eph B4信号、MAPKs和PI3K/Akt通路可在张力的刺激下发生活化。第二部分:机械张力通过ephrinB2-EphB4正向信号促进成骨细胞分化的研究实验目的:验证ephrinB2-EphB4正向信号介导机械张力促成骨细胞分化的作用。实验方法:成骨诱导后,采用Eph B4受体特异性阻断剂NVP-BHG712处理MC3T3-E1。对MC3T3-E1施加2000με的机械张力,加力持续6 h。随后,分别通过ALP活性、ALP染色、茜素红染色、q PCR和western blot方法检测细胞中成骨分化相关因子的表达水平。实验结果:阻断Eph B4受体的结果显示,NVP-BHG712可有效抑制MC3T3-E1中p-Eph B4的表达水平,但对Eph B4的表达无明显影响。ALP活性和ALP染色结果显示,与单纯加力组相比,阻断了Eph B4受体后,机械张力促MC3T3-E1表达ALP的能力显著下降。茜素红染色结果显示,当Eph B4受体被阻断后,机械张力促成骨细胞矿化的能力也随之降低。q PCR和western blot结果显示,与加力组相比,阻断了Eph B4受体后,机械张力促MC3T3-E1表达RUNX2、OPN和OCN的作用也随之减弱。结论:NVP-BHG712可有效抑制MC3T3-E1中Eph B4受体的磷酸化。机械张力促成骨分化可通过Ephrin B2-Eph B4正向信号介导。第三部分:机械张力通过ephrinB2-EphB4正向信号调节大鼠OTM牵张侧骨沉积的研究实验目的:明确ephrinB2-EphB4信号对大鼠OTM牵张侧骨沉积的影响。实验方法:建立OTM大鼠模型:将正畸镍钛拉簧的两端分别固定于SD雄性大鼠上颌第一磨牙和切牙,拉簧拉开的力值为50g。动物模型分组（n=5）:OTM组（建模,牙周注射生理盐水）、ephrin B2-Fc组（建模,牙周注射Eph B4受体特异性激动剂ephrin B2-Fc,2 mg/kg/天）、NVP-BHG712组（建模,牙周注射NVP-BHG712,5 mg/kg/天）、ephrin B2-Fc+NVP-BHG712组（建模,牙周注射ephrin B2-Fc和NVP-BHG712,2 mg/kg/天+5 mg/kg/天）。治疗7天后取样,通过micro-CT扫描大鼠上颌牙槽骨,测量第一磨牙移动的距离。通过IHC法,检测大鼠OTM牵张侧牙周组织中ephrin B2、Eph B4、p-Eph B4的表达水平。采用H＆E染色法,观察大鼠OTM牵张侧牙槽骨形态的变化。通过micro-CT扫描重建,观察大鼠OTM牵张侧牙槽骨结构的变化,使用分析软件对牙槽骨骨小梁参数进行分析。实验结果:三个实验组的大鼠上颌第一磨牙移动距离与OTM组相比无明显差异。IHC结果显示,与对照侧相比,大鼠OTM牵张侧牙周组织中,ephrin B2、Eph B4、和p-Eph B4阳性细胞的数量均显著增加。H＆E染色结果显示,与OTM组相比,ephrin B2-Fc组大鼠OTM牵张侧牙槽骨量更多,骨小梁密度更高;NVP-BHG712组牙槽骨量明显减少且骨小梁密度稀疏;ephrin B2-Fc+NVP-BHG712组牙槽骨量较NVP-BHG712组略高但仍低于ephrin B2-Fc组。Micro-CT结果显示,与OTM组相比,ephrin B2-Fc组大鼠OTM牵张侧牙槽骨密度显著增加,骨体积分数（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th.）、骨小梁数目（Tb.N.）均显著提升,骨小梁间距（Tb.Sp.）显著降低;NVP-BHG712组牙槽骨密度明显降低,BV/TV、Tb.N.下降,而Tb.Sp.上升;与NVP-BHG712组相比,ephrin B2-Fc+NVP-BHG712组大鼠牙槽骨的BV/TV和Tb.N.均有所增加,但仍低于ephrin B2-Fc组。结论:正畸牵张力可促进牙周组织中ephrin B2和Eph B4的表达,同时,牵张力可上调牙周组织中ephrinB2-EphB4正向信号的激活。Ephrin B2-Eph B4正向信号对大鼠OTM牵张侧骨形成具有促进作用。第四部分:Ephrin B2-Eph B4正向信号通过ERK1/2和PI3K/Akt通路介导机械张力促成骨分化的研究实验目的:验证ephrinB2-EphB4正向信号通过ERK1/2、PI3K/Akt通路介导机械张力促成骨分化。实验方法:采用NVP-BHG712阻断ephrinB2-EphB4正向信号。对MC3T3-E1施加2000με的机械张力。通过western blot法检测MC3T3-E1中p-ERK1/2、p-p38、p-JNK、p-PI3K和p-Akt的蛋白水平。成骨诱导后,分别使用ERK1/2通路阻断剂trametinib和PI3K通路阻断剂LY294002处理MC3T3-E1,加载机械张力后,通过q PCR和western blot法检测细胞中RUNX2、OPN和OCN的表达水平。实验结果:Western blot结果显示,与加力组相比,阻断ephrinB2-EphB4信号后,机械张力促MC3T3-E1中ERK1/2、PI3K和Akt通路蛋白磷酸化的作用被抑制,而p38和JNK蛋白磷酸化水平无明显变化。阻断ERK1/2和PI3K通路后,与加力组相比,机械张力促MC3T3-E1成骨分化的作用也被抑制,并且这种抑制作用无法被Eph B4受体特异性激动剂ephrin B2-Fc逆转。结论:Ephrin B2-Eph B4正向信号介导机械张力促MC3T3-E1中ERK1/2和PI3K/Akt通路的激活。ERK1/2和PI3K/Akt通路可作为Ephrin B2-Eph B4正向信号的下游通路介导机械张力促MC3T3-E1成骨分化。