第一部分 缺氧对巨噬细胞表型及功能的影响背景:经典的巨噬细胞可分为促炎型巨噬细胞（M1型）及抑炎型巨噬细胞（M2型）。前者在肿瘤中发挥抑瘤效应,后者则具有促瘤作用。缺氧是包括黑素瘤在内的多种实体瘤的共同特征。然而黑素瘤缺氧微环境下不同表型及功能的巨噬细胞在肿瘤进展与转移中所起的作用及机制仍不明确。因此,深入探究黑素瘤缺氧微环境对巨噬细胞表型及功能的影响及调控机制具有十分重要的意义。目的:研究缺氧对骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）表型及功能的影响。方法:Western blot法检测不同缺氧培养时间下BMDMs中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和缺氧诱导因子-2α（HIF-2α）的表达水平变化;流式细胞术检测缺氧培养后BMDMs表面M1型表面标志分子（CD86、CD16/32及MHC-II）、M2型表面标志分子（CD206）以及免疫抑制分子PD-L1的表达变化,以及加入HIF-1α抑制剂后PD-L1的表达变化;ELISA法检测BMDMs缺氧培养后M1型细胞因子TNF-α和M2型细胞因子IL-10的水平及加入HIF-1α抑制剂后TNF-α的水平变化;CCK8法检测在常氧及缺氧条件下不同浓度HIF-1α抑制剂对BMDMs增殖能力的影响。结果:BMDMs经缺氧培养后HIF-1α表达增加而极少表达HIF-2α,缺氧培养24 h后BMDMs显著上调M1型巨噬细胞表面标志分子CD86（p<0.05）、CD16/32（p<00.01）、MHC Ⅱ（p<0.01）和抑制性分子PD-L1（p<0.01）的表达,同时下调M2型巨噬细胞表面标志分子CD206的表达（p<0.01）。此外,在缺氧培养24 h后,BMDMs分泌M2型细胞因子IL-10明显减少（p<0.05）,而其分泌的M1 型细胞因子 TNF-α水平在缺氧 6h（p<0.0001）、12 h（p<0.0001）、24 h（p<0.0001）及48 h（p<0.0001）后均显著增高,且缺氧所致TNF-α水平的升高可被HIF-1α抑制剂抑制（p<0.001）。在常氧及缺氧条件下,浓度在20 μM以内的HIF-1α抑制剂对BMDMs的增殖能力都无明显抑制作用。结论:缺氧可诱导BMDMs中HIF-1α表达上调,促进其分泌M1型细胞因子TNF-α并向M1型巨噬细胞表型分化,同时抑制其分泌M2型细胞因子IL-10及向M2型巨噬细胞分化。第二部分 缺氧培养的巨噬细胞诱导VSMC向HEV转化的研究背景:三级淋巴结构（TLS）是具有类似次级淋巴器官（SLO,如脾脏和淋巴结）结构与功能的异位淋巴组织。文献报道,多种实体瘤（如NSCLC、结肠癌和黑素瘤等）组织中均存在TLS,且肿瘤患者及肿瘤组织中具有TLS者预后较无TLS者为佳,且TLS数量多者预后较好。高内皮微静脉（HEV）是TLS中最重要的组成结构,是淋巴细胞进入肿瘤组织的主要门户。然而在TLS中HEV的来源与发生尚不清楚。血管平滑肌细胞（VSMC）已被证实可模拟SLO中的淋巴组织者细胞（LTo）,后者在淋巴组织诱导细胞（LTi）分泌的淋巴毒素（LT）或肿瘤坏死因子α（TNF-α）的诱导下转化为HEV。HEV可分泌大量趋化因子如CCL19、CXCL13和CCL21,招募T、B淋巴细胞聚集进而促进TLS形成。我们选取VSMC作为LTo的模拟细胞,将其与缺氧培养的BMDMs上清共孵育,检测缺氧培养的BMDMs对VSMC分泌CCL19以及CXCL13的影响,以此证明缺氧条件下BMDMs是否能够诱导VSMC向HEV分化。目的:研究缺氧培养的BMDMs对VSMC向HEV分化的诱导作用。方法:ELISA法检测常氧与缺氧培养条件下BMDMs对VSMC分泌CCL19和CXCL13的影响。结果:缺氧培养的BMDMs不分泌CXCL13而明显分泌CCL19（p<0.05）。缺氧培养后的BMDMs上清能明显促进VSMC分泌CCL19（p<0.01）和CXCL13（p<0.0001）,且该促进作用能被HIF-1α抑制剂抑制（p<0.05）。结论:缺氧培养的BMDMs能促进VSMC分泌CCL19和CXCL13进而获得HEV功能,且HIF-1α可能参与此过程。第三部分 巨噬细胞促进黑素瘤HEV生成的体内研究背景:高内皮微静脉（HEV）是肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）进入肿瘤组织的重要门户。文献报道,黑素瘤患者其肿瘤组织中HEV数量多者,其TIL数量也较多,患者预后较好。因此,诱导黑素瘤HEV生成是增加肿瘤组织中TIL数量进而改善患者预后的关键因素。在前两部分我们的体外实验已证明缺氧培养下的BMDMs具有类似LTi的作用,即可大量分泌TNF-α并诱导VSMC向HEV分化。这一部分我们将进一步研究和证实体内巨噬细胞对黑素瘤HEV生成的促进作用。目的:体内研究巨噬细胞对黑素瘤组织中HEV生成的促进作用,并进一步探究肿瘤缺氧微环境对巨噬细胞的影响以及对黑素瘤HEV生成的调控作用。方法:不同时期清除巨噬细胞与未清除巨噬细胞的黑素瘤荷瘤小鼠,瘤内注射缺氧或常氧培养后的BMDMs后,流式细胞术检测瘤内CD3 1+PNAd+HEV数量以及CD45+TIL及各淋巴细胞亚群数量的变化。免疫组化法检测小鼠淋巴结与瘤内缺氧程度及周围淋巴结区素（PNAd,为HEV特征性表面标志）的表达变化。结果:与PBS对照组相比,黑素瘤荷瘤小鼠清除巨噬细胞后瘤内CD31+PNAd+HEV例明显降低（p<0.0001）,同时瘤内CD45+TIL比例下降（p<0.0001）,CD3+B220-T细胞比例下降尤为显著（p<0.001）。肿瘤引流淋巴结（TDLN）内PNAd+细胞在清除巨噬细胞后的荷瘤小鼠肿瘤内几乎难以观察到,而在未清除巨噬细胞的PBS对照组中可见。与瘤内注射常氧培养BMDMs的荷瘤小鼠相比,注射缺氧培养后的BMDMs组小鼠瘤内HEV（p<0.05）及总CD45+细胞比例升高（p<0.05）,特别是CD3+B220-T淋巴细胞比例升高尤为显著（p<0.05）。同时,通过免疫组化法对PNAd进行染色后发现,瘤内注射缺氧培养的BMDMs组可观察到更多呈管腔样结构的PNAd+细胞。此外,利用缺氧探针结合免疫组化染色法显示肿瘤内部的缺氧程度高于瘤周,TDLN的缺氧程度高于非引流淋巴结。且随肿瘤生长,其缺氧程度进一步加重。结论:体内实验表明,清除巨噬细胞后会导致黑素瘤荷瘤小鼠瘤内HEV数量显著降低,肿瘤内TIL数量减少。缺氧培养的巨噬细胞可显著促进黑素瘤内HEV生成,进而增加黑素瘤内TIL浸润。第四部分 纳米粒靶向巨噬细胞的相关研究背景:巨噬细胞介导的固有免疫在抗肿瘤免疫应答中具有重要作用。由于巨噬细胞表型和功能的多样性,将具有促瘤作用的M2型巨噬细胞“重编程”使其转化为具有抑瘤功能的M1型巨噬细胞对提高肿瘤治疗的疗效具有重要研究价值。然而,传统药物及给药系统难以特异性靶向巨噬细胞。因此,设计与合成一种可靶向巨噬细胞的纳米载体在实现诱导巨噬细胞功能转化中具有重大意义。作为专职吞噬细胞,巨噬细胞通过其表面吞噬相关受体（如Mer及Tim-4等）特异性识别表达磷脂酰丝氨酸（PS）的凋亡细胞。基于金纳米结构的纳米粒（如金纳米笼）具有生物惰性、低细胞毒性以及独特的光声成像功能,因而在生物医学研究中得以广泛应用。此外,金纳米笼还具备中空与薄壁多孔结构,可提高载药量并利于药物释放。据此,通过PS表面修饰的载药金纳米笼可特异性靶向巨噬细胞,有效实现对其表型和功能的调控。目的:探索靶向巨噬细胞的纳米递送系统的靶向性、特异性和高效性,研究其对体内其他免疫细胞的影响,并观察其体内成像的效果。方法:流式检测巨噬细胞表面吞噬相关受体（主要为PS受体）的表达情况,并在封闭PS受体后检测巨噬细胞对纳米递送载体的吞噬情况。将该纳米粒与T、B和DC细胞共孵育后用流式检测表面活化分子的变化情况。通过光声成像系统检测尾静脉注射纳米粒后小鼠肝、脾和肾的纳米载体信号。结果:PS受体Tim-4和Mer在小鼠巨噬细胞表面均有表达,其表达丰度前者约有16.8%,后者约为80%。在封闭BMDMs表面Tim-4和/或Mer后BMDM摄取纳米粒明显减少（p<0.0001）。该靶向递送载体对DC表面的CD86与MHC-Ⅱ分子表达,以及对T、B细胞表面的CD43、CD69和CD25分子的表达均无明显影响。该靶向递送系统经尾静脉注射12 h后通过光声成像系统检测到的肝、脾、肾的纳米载体光声信号强于非靶向载体信号。结论:我们设计合成的表面修饰PS的纳米粒主要通过与巨噬细胞表面PS受体特异性结合,被巨噬细胞识别并吞噬,从而实现巨噬细胞特异性靶向递送。同时该纳米粒具有良好的生物惰性,并可进行体内示踪。