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葡萄是世界上具有重要经济价值的果树,其栽培面积和产量位居全球果业第二。随着人们对葡萄及其制品中营养成分的研究,特别是特异功能成分白藜芦醇的含量为各类水果之首,其具抗癌、防心血管病的功效,使近年来世界范围内葡萄与葡萄酒产业得到了迅猛发展。目前,世界上欧洲葡萄(Vitis vinifera L.)栽培面积广,果实品质好,但其抗病性差,尤其是葡萄白粉病、灰霉病、霜霉病等真菌病害,每年给生产上造成巨大的损失。近年来植物抗病分子机理在拟南芥、烟草、水稻等模式植物中已被广泛研究,其中WRKY转录因子在植物抗病反应过程中发挥重要的调控功能。本课题组前期系统开展了葡萄WRKY转录因子家族生物信息学分析及抗病、感病野生葡萄资源在不同病原菌诱导下的差异基因表达分析,筛选出了白粉菌诱导显著差异表达的VqWRKY52基因。本研究在此基础上,利用先进的CRISPR/Cas9基因组编辑技术,建立了一套成熟的葡萄CRISPR/Cas9基因组编辑体系,实现了VvWRKY52基因的纯合突变,获得了VvWRKY52功能缺失的葡萄突变体材料,并利用过表达和CRISPR/Cas9基因组编辑获得的基因沉默转基因葡萄材料开展了WRKY52基因抗白粉病功能研究及参与葡萄抗白粉病的调控机理的研究。主要研究结果如下:1、利用模式植物初步鉴定了VqWRKY52基因抗白粉病功能。用水杨酸(SA)处理葡萄叶片,结果表明VqWRKY52可以受SA的诱导表达,之后进行了烟草瞬时转化实验,结果同样表明VqWRKY52可以受SA的诱导表达。为了进一步鉴定VqWRKY52的功能,将VqWRKY52在拟南芥中异源表达。其过表达株系增强了拟南芥对白粉菌和丁香假单胞菌的抗性,但降低了对灰霉菌的抗性。同时,台盼蓝染色发现,过表达株系在接种病原菌后出现了强烈的过敏反应,暗示了VqWRKY52基因可能通过调控过敏反应的强弱来增强对病原菌的抗性。此外,在不同病原菌侵染后,比较了转基因株系和野生型植株之间各种防御相关基因的相对表达水平,结果表明,过表达株系中SA信号通路被加强。所有这些结果表明VqWRKY52在SA依赖性信号转导途径中起重要作用,并且它可以增强病原菌诱导的过敏反应来调控植物对病原菌的抗性。2、建立了葡萄CRISPR/Cas9基因组编辑体系,获得了VvWRKY52突变体材料和过表达株系。利用CRISPR/Cas9多靶点编辑系统,针对VvWRKY52基因的第一外显子区域设计了四个靶点,构建了植物表达载体,并通过农杆菌介导的葡萄原胚团遗传转化方法,成功获得了72株转基因再生植物。对转基因第一代植物进行DNA水平鉴定,证实了72个株系均为阳性植株,之后,在72个阳性株系中鉴定得到了22个突变株系。其中,15个株系是等位基因纯合突变,7个株系是杂合突变。在突变株系中发现了一系列编辑事件,包括大片段的缺失,少量碱基的缺失和插入,其中少量碱基的缺失是最常出现的突变类型。同时还发现,不同的靶点之间可以协同作用,实现对目标区域的精确敲除。表明了CRISPR/Cas9技术可以在葡萄上实现一个基因或多个基因的同时功能缺失,也可以对某些基因的特定结构域进行精确的敲除。另外,对所有四个靶点潜在的脱靶位点进行了突变检测,结果并没有发现脱靶事件。此外,葡萄中VvWRKY52的功能缺失株系增加了对灰霉菌的抗性。同时,本研究构建了VqWRKY52过表达载体,通过葡萄遗传转化获得了VqWRKY52基因的过表达株系,通过DNA和RNA水平鉴定获得了阳性的过表达株系。之后将所有的过表达株系和功能缺失株系进行了大量扩繁和炼苗。3、明晰了葡萄WRKY52基因抗白粉菌功能及其调控机理。对WRKY52基因的葡萄过表达株系,功能缺失株系和野生型WT接种了白粉菌,结果表明过表达株系显著增强了对白粉菌的抗性,而功能缺失株系降低了对其的抗性。随后本研究对白粉菌接种后的叶片进行了转录组分析。通过对差异基因的功能富集发现,过表达株系中木质素合成途径相关基因在本底水平被加强了,而在功能缺失株系中被抑制了,这表明了WRKY52基因可以通过调控植物木质素合成来调控对病原菌的抗性。同时在功能缺失株系中,大量的超出正常水平的差异基因被发现,推测这可能是功能缺失株系本身的免疫反应因WRKY52基因的缺失而被打破的一个信号,植物需要调用更多的资源来抵抗病原菌的侵入。随后,在受WRKY52基因影响的各差异基因集合中进行了启动子区域的motif和转录因子富集分析,结果表明WRKY52基因可能通过调控bHLH,NAC,ERF等转录因子来实现对不同生物学过程的调控。同时,本研究通过WGCNA的分析,找到了与WRKY52基因表达模式类似grey60模块,随后本研究在grey60模块中均受过表达和功能缺失后差异表达的基因集合中也富集到了bHLH,NAC,ERF和WRKY等转录因子,后在这些基因启动子区域发现了大量的W-box。综合这些结果表明,WRKY52基因可以调控bHLH,NAC,ERF等转录因子,之后这些转录因子再来调控下游相关的抗病信号通路。