我们前期研究发现血清和糖皮质激素调节激酶3(Serum and glucocorticoid kinase 3,SGK3)能够促进肝癌细胞发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)进而促进肝癌细胞的侵袭和迁移,但其是否参与调控肝癌干细胞干性还不清楚。PI3K信号通路(通常指I型PI3K)异常调节在各种恶性肿瘤中非常普遍,Akt一直被认为是PI3K信号通路中至关重要的中转信号分子,近年来,有研究证实SGK3是I型PI3K通路下游不依赖Akt的独立调控分子,而SGK3在I型PI3K信号通路中的作用及机制仍未阐明。Ⅲ型PI3K(PIK3C3)又被称作Vps34,在细胞自噬和胞吞过程中发挥重要作用。PIK3C3还是生成PtdIns(3)P的重要场所,PtdIns(3)P是细胞内的重要第二信使,能够激活含PX和FYVE结构域的蛋白质。有报道称,PIK3C3在结肠癌、乳腺癌等多种肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用,但是其是否参与了肿瘤干细胞的调控还未见相关报道。第一部分抑制PI3K对肝癌干细胞自我更新的影响及机制研究目的:探究SGK3在肝癌干细胞自我更新中的作用及机制,以及揭示PI3K通路对SGK3的调控作用及机制。方法:1.我们利用无血清悬浮培养法培养细胞球,并用免疫磁珠分选法从肝癌细胞中分离CD133+细胞,利用qPCR和Western blot检测SGK3在细胞球和CD133+细胞中的表达。2.构建SGK3稳定过表达细胞株,利用qPCR和Western blot检测SGK3过表达对肝癌干细胞相关基因表达的影响,检测SGK3过表达对细胞成球能力的影响。3.构建shRNA载体,敲低SGK3的表达,利用qPCR和Western blot检测SGK3下调对肝癌干细胞相关基因表达的影响,检测SGK3下调对细胞成球能力的影响。4.使用PI3K抑制剂处理肝癌细胞,Western blot检测抑制PI3K对SGK3磷酸化水平的影响,并利用qPCR、Western blot和流式细胞术检测PI3K抑制对肝癌干细胞干性相关标志物表达的影响,利用细胞无血清悬浮培养法验证抑制PI3K对细胞成球能力的影响,以口头给药的方式在裸鼠移植瘤模型中检测PI3K抑制剂对肿瘤生长及肝癌干细胞自我更新的影响。5.使用PIK3C3抑制剂处理肝癌细胞,利用Western blot检测PIK3C3抑制剂对SGK3磷酸化的影响,并通过qPCR、Western blot和流式细胞术检测PIK3C3抑制剂对肝癌干细胞干性相关标志物表达的影响,利用细胞无血清悬浮培养法验证抑制PI3K对细胞成球能力的影响。6.过表达/敲低SGK3后,利用Western blot检测GSK3β、β-catenin的表达变化,使用GSK3β抑制剂处理肝癌细胞,检测抑制GSK3β对肝癌干细胞自我更新的影响。使用GSK3β抑制剂处理SGK3过表达细胞株,检测抑制GSK3β能否逆转过表达SGK3对细胞成球的促进作用。结果:1.与贴壁细胞相比,干细胞相关基因在细胞球中表达明显增加,SGK3在细胞球中磷酸化水平明显增高。与CD133-细胞相比,干细胞相关基因在CD133+细胞中表达明显增加,SGK3在CD133+细胞中磷酸化水平明显增高。2.SGK3过表达促进干细胞相关基因表达,促进肝癌细胞成球。相反,下调SGK3表达后,干细胞相关基因表达明显降低,肝癌细胞成球能力明显被抑制,并且CD133+细胞比例明显减小。3.在肝癌细胞培养基中加入PI3K抑制剂后,SGK3的磷酸化程度随着PI3K抑制剂的浓度增加而增加,并且随着PI3K抑制剂的处理时间延长而增加。另外,我们还发现,抑制PI3K后干细胞相关基因表达增加。沉默SGK3的表达能在一定程度上回复(rescue)PI3K抑制引起的干细胞相关基因表达增加。在体内实验中,PI3K抑制剂能够显著抑制肿瘤的生长,但是也明显促进CD133+肝癌干细胞扩增。4.PIK3C3抑制剂VPS34-IN-1能够显著抑制SGK3磷酸化,并且干细胞相关基因在VPS34-IN-1处理后表达明显降低,细胞成球能力也明显被VPS34-IN-1抑制。另外,VPS34-IN-1能够显著抑制PI3K抑制剂引起的肝癌干细胞扩增。5.在细胞球中GSK3β(Ser9)位点磷酸化程度明显增高,过表达SGK3促进GSK3β(Ser9)位点磷酸化及β-catenin的表达,下调SGK3后明显抑制GSK3β(Ser9)位点磷酸化及β-catenin的表达。抑制剂抑制GSK3β能够抑制CD133的表达,并且抑制GSK3β能够阻断SGK3过表达对细胞成球的促进作用。6.我们还发现抑制PI3K促进β-catenin的表达,而下调SGK3能够回复由PI3K抑制剂引起的β-catenin表达增加。结论:SGK3通过调控GSK3β/β-catenin通路在肝癌干细胞自我更新中发挥重要作用。抑制PI3K通过激活SGK3促进肝癌干细胞自我更新,这可能是肝癌细胞耐受PI3K抑制剂的重要原因。抑制PIK3C3能够通过抑制SGK3活化抑制肝癌干细胞自我更新。第二部分抑制PIK3C3对肝癌干细胞自我更新的影响及机制研究目的:深入探究PIK3C3在肝癌干细胞自我更新过程中的重要作用,以及进一步解析抑制PIK3C3对肝癌干细胞抑制的效果及机制。方法:1.通过免疫组化检测PIK3C3在肝癌与癌旁组织中的表达差异,分析PIK3C3与患者预后的相关性,分析在肝癌组织中PIK3C3表达与肝癌干细胞标志物CD133表达的相关性。利用无血清悬浮培养法培养肝癌细胞球,免疫磁珠分选法从肝癌细胞中分离CD133+细胞,Western blot及qPCR检测细胞球和CD133+细胞中PIK3C3的表达情况。2.构建PIK3C3稳定过表达细胞株,使用Western blot及qPCR检测PIK3C3过表达细胞与对照细胞中肝癌干细胞相关基因的表达,检测PIK3C3过表达对肝癌细胞成球能力的影响。使用siRNA干扰肝癌细胞中PIK3C3的表达后,使用Western blot及qPCR检测PIK3C3下调对肝癌细胞中干性相关基因表达的影响。3.使用PIK3C3抑制剂处理肝癌细胞后,利用Western blot及qPCR检测PIK3C3抑制剂对肝癌干细胞相关基因表达的影响,利用流式细胞术检测PIK3C3抑制剂对CD133+、CD90+细胞比例的影响。使用PIK3C3抑制剂预处理肝癌细胞24小时后,检测肝癌细胞成球和梯度稀释成瘤能力的变化。待裸鼠皮下瘤生长到~400mm~3,使用PIK3C3抑制剂给成瘤后的裸鼠灌胃,检测肿瘤生长情况及肿瘤中CD133表达情况。4.利用Western blot检测PIK3C3抑制或下调后自噬标志物LC3和P62的表达变化。Western blot、qPCR和流式细胞术检测Rapamycin激活自噬能否逆转VPS34-IN-1对肝癌干细胞标志物表达的抑制作用。5.Western blot检测PIK3C3抑制后对p-AMPK/AMPK表达的影响。使用AMPK激动剂AICAR和二甲双胍激活AMPK后,利用Western blot及qPCR检测干性相关基因的表达变化。使用AMPK抑制剂抑制AMPK及siRNA干扰AMPK表达后,利用Western blot及qPCR检测干细胞相关基因的表达变化。利用Western blot及qPCR检测抑制AMPK功能能否逆转VPS34-IN-1对干细胞相关基因的抑制作用。6.使用抑制剂联合抑制PIK3C3和PI3K后,利用Western blot及qPCR检测干性相关基因的表达的变化,利用流式细胞术检测CD133+细胞比例的变化,利用细胞成球实验检测细胞成球能力的变化。待裸鼠皮下成瘤后,将裸鼠分为四组:1.对照组2.VPS34-IN-1组3.ZSTK474组4.VPS34-IN-1+ZSTK474组,并按照以上分组给裸鼠灌胃,检测肿瘤生长及终末期肿瘤组织内CD133表达情况。结果:1.PIK3C3在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织,并且PIK3C3表达高的患者生存率明显低于PIK3C3表达低的患者。在肝癌组织中,PIK3C3与CD133的表达存在显著正相关。PIK3C3在肝癌干细胞中明显高表达。2.与对照组相比,PIK3C3下调明显抑制干细胞相关基因的表达,与此相反,过表达PIK3C3显著促进肝癌干细胞相关基因的表达。过表达PIK3C3明显促进肝癌细胞在干细胞培养基中的成球能力。3.抑制剂抑制PIK3C3后,干细胞相关基因表达明显降低,CD133+和CD90+细胞比例明显减少,肝癌细胞成球能力明显被抑制。梯度稀释成瘤实验结果显示:VPS34-IN-1预处理肝癌细胞24小时明显抑制肝癌细胞的成瘤能力。VPS34-IN-1给予皮下成瘤的裸鼠灌胃能够抑制肿瘤的生长,并且瘤内CD133表达明显降低。4.抑制PIK3C3能够明显抑制自噬,而激活自噬不能逆转PIK3C3抑制剂对肝癌干细胞相关基因的抑制。Rapamycin能够增强PIK3C3抑制剂对肝癌干细胞的抑制作用。并且自噬抑制剂Chloroquine处理肝癌细胞没能重复出PIK3C3抑制剂对肝癌干细胞的抑制作用。5.PIK3C3被抑制后,AMPK(Thr172)磷酸水平明显增高。AICAR和二甲双胍激活AMPK能够抑制肝癌干细胞自我更新。Compound C抑制AMPK或siRNA下调AMPK能够明显促进肝癌干细胞相关基因表达。并且Compound C抑制AMPK或siRNA下调AMPK能够阻断VPS34-IN-1对肝癌干细胞干性的抑制作用。6.联合抑制PIK3C3和PI3K后,肝癌干细胞相关基因表达显著降低,细胞成球能力显著被抑制。体内实验发现,PIK3C3和PI3K抑制剂联合应用,肿瘤生长被显著抑制,并且与单独抑制PIK3C3相比,联合使用两种抑制剂使肿瘤内CD133表达更加减少。结论:PIK3C3在肝癌干细胞自我更新过程中发挥重要作用,抑制PIK3C3通过激活AMPK进而抑制肝癌干细胞自我更新。PIK3C3在细胞自噬过程中发挥重要作用,但是抑制PIK3C3对肝癌干细胞干性的抑制作用并不是通过抑制自噬实现的。PIK3C3抑制剂能够显著阻断PI3K抑制剂对肝癌干细胞自我更新的促进作用。