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研究背景近年来的研究表明,乳腺癌是一种高度异质的疾病,由五种在形态、基因表达谱、生物学和临床后果差异明显的分子亚型组成。随着乳腺癌肿瘤干细胞的证实,人们认识到乳腺癌的分子亚型和白血病的亚型类似,彼此间可能是细胞起源不同的独立性疾病实体。因此推测各分子亚型有生物学功能和细胞表型不同的肿瘤干细胞。为此,本研究选取五个分子亚型中差别最为明显的基底样乳腺癌和管腔A乳腺癌,分别分离培养各自的干/祖细胞,对比研究两种细胞的生物学功能和细胞表型。第一部分乳腺癌干/祖细胞的分离培养与鉴定目的从人乳腺癌新鲜组织分离、培养具有干细胞样特性的肿瘤细胞,通过细胞表型鉴定,结合体内、外功能分析,鉴定其是否具有肿瘤干细胞的生物学特性,并进一步探讨了乳腺癌细胞原代无血清培养的影响因素。方法将乳腺癌细胞接种于添加生长因子的无血清培养基,通过乳腺癌微球(mammosphere, MS)无血清悬浮培养富集乳腺癌干/祖细胞；应用连续无血清传代培养生成MS检测乳腺癌微球细胞(mammosphere-derived cells, MSDCs)的自我更新能力,血清诱导检测其分化能力；采用间接免疫荧光标记、激光共聚焦扫描镜观测MSDCs的CD34、神经巢蛋白(Nestin)和上皮特异性抗原(ESA)的表达；构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察MSDCs的成瘤情况和组织学特点。结果30例未化疗乳腺癌标本除2例污染外均成功培养出MS,12例化疗后乳腺癌标本有5例未获得足够的乳腺癌细胞,另7例富集MS,能在无血清培养基中形成MS; MSDCs分化前后呈ESA阳性表达,但均不表达CD34、nestin蛋白,证明其为上皮干细胞来源；MSDCs不仅可在无血清培养基中连续传代形成MS,能经血清诱导多向分化,还能在裸鼠体内形成与原发瘤性质相同的移植瘤,表现出干细胞样特性。结论本研究从乳腺癌新鲜组织分离培养获取的MSDCs为具有肿瘤干细胞生物学特性的乳腺癌细胞,可用于乳腺癌干/祖细胞的实验研究。第二部分基底样乳腺癌与管腔A乳腺癌干/祖细胞的干细胞生物学行为比较目的从人基底样乳腺癌和管腔A乳腺癌新鲜组织分离、培养具有干细胞样特性的肿瘤细胞,比较其体外的增殖能力、自我更新能力和分化能力以及在体内的生长能力,探讨其生物学特点与临床病理特点的关系。方法将乳腺癌细胞接种于添加生长因子的无血清培养基,通过无血清非粘附性乳腺癌微球培养富集两个乳腺癌亚型的MSDCs;通过体外无血清培养并测定生长曲线,评估两种MSDCs的增殖能力；应用连续无血清克隆形成实验,计算乳腺癌微球形成效率(mammosphere forming efficiency, MSFE),比较两种MSDCs的自我更新能力；血清诱导分化并测定生长曲线,评估两种MSDCs的分化能力；构建裸鼠皮下移植瘤模型,比较移植瘤的生长情况和组织学特点。结果基底样乳腺癌和管腔A乳腺癌均成功培养出MS,基底样乳腺癌的MS生长速度快,密度大,MS体积大,包含的细胞数量多；基底样乳腺癌MSDCs倍增时间短,生长曲线迅速上升,管腔A乳腺癌MSDCs倍增时间长,生长曲线则走行平缓,两者增殖活力有显著性差别(P<0.05)；基底样乳腺癌和管腔A乳腺癌的MSDCs均可在无血清培养基中连续传代形成MS,基底样乳腺癌比管腔A乳腺癌具有更高的原代细胞MSFE,但基底样乳腺癌传代过程中,细胞容易贴壁分化,MSFE持续下降,传代多不超过15代；而管腔A乳腺癌,虽然丧失克隆性成能力的悬浮单细胞明显增多,但贴壁分化细胞较少,MSFE下降较慢,均可传代20次以上；经血清诱导后,基底样乳腺癌MSDCs比管腔A乳腺癌的MSDCs分化早,增殖更快。基底样乳腺癌MSDCs在裸鼠体内形成的移植瘤生长速度比管腔A乳腺癌的MSDCs的移植瘤快,呈现低分化、血管丰富的恶性肿瘤病理特征。结论基底样乳腺癌MSDCs有更强的增殖能力和自我更新能力、分化能力,但因容易分化导致传代形成克隆的能力下降。第三部分基底样乳腺癌与管腔A乳腺癌干/祖细胞的表型特征比较目的从人基底样乳腺癌和管腔A乳腺癌新鲜组织分离、培养具有干细胞样特性的肿瘤细胞,比较其体外分化前后的细胞表型变化,进一步探讨其细胞起源和异质性形成的机制。方法制作细胞涂片,间接免疫荧光化学检测细胞角蛋白CK14、CK18和CK19在基底样乳腺癌和管腔A乳腺癌MSDCs分化前后的表达情况；流式细胞术检测CD44和CD24在基底样乳腺癌和管腔A乳腺癌MSDCs分化前后的表达情况及CD44+CD24-细胞的含量；分析原代细胞内CD44+CD24-细胞的含量与MSFE的关系。结果基底样乳腺癌的MSDCs呈CK19+/CK14+CK18-,经血清诱导分化后,表达管腔上皮标志CK18和肌上皮标志CK14；管腔A乳腺癌的MSDCs表型呈CK18+/CK19+/CK14-,经诱导分化后表达管腔上皮标志CK18和CK19,不表达肌上皮细胞标志CK14; CD24在基底样乳腺癌表达极低或无表达,但在管腔A乳腺癌高表达。基底样乳腺癌原代细胞CD44-/CD24细胞的含量较高,含CD44+/CD24-/low细胞2.52%±0.58%,而管腔A乳腺癌含量最高的是CD44-/CD24+细胞,但不含CD44+/CD24-/low细胞或含量极低基底样乳腺癌和管腔A乳腺癌基底样乳腺癌CD44-/CD24-细胞的含量较高,均含有CD44+/CD24"/low细胞,而管腔A乳腺癌含量最高的是CD44-/CD24+细胞,13例标本中只有3例检出CD44+/CD24-/low细胞,且含量均低于1%。结论基底样乳腺癌和管腔A乳腺癌MSDCs有不同的细胞表型,两者的分化能力和分化方向也不同,可能有不同的细胞起源。