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第一部分Hsa-let-7c对牙周膜干细胞增殖的影响研究目的:分离培养牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs),通过慢病毒转染使其过表达及低表达hsa-let-7c,研究hsa-let-7c对牙周膜干细胞增殖活性和细胞增殖周期的影响。研究方法:本实验联合采用酶消化法和组织块法进行牙周膜干细胞的原代培养,经传代后第3至5代用于实验。用MOI=5比例的hsa-let-7c过表达和低表达慢病毒载体分别转染牙周膜干细胞,实时定量逆转录聚合酶链反应(Real-time RT-PCR)方法鉴定慢病毒转染后牙周膜干细胞hsa-let-7c基因的表达水平。采用CCK8试剂盒检测各组细胞的增殖活性,绘制细胞生长曲线;流式细胞术(FCM)对细胞周期分布进行检测,计算细胞增殖指数(PI)。实验结果:牙周膜干细胞贴壁生长,在显微镜下观察为长梭形,呈成纤维细胞样形态。用MOI=5比例的hsa-let-7c过/低表达慢病毒载体转染牙周膜干细胞72小时后,倒置荧光显微镜下观察慢病毒转染率高,细胞生长状态良好。经RT-PCR鉴定,两组牙周膜干细胞分别较对照组过表达以及低表达hsa-let-7c,差异具有统计学意义(P<0.05)。CCK8及FCM结果显示:hsa-let-7c过表达及低表达的牙周膜干细胞其增殖活性及细胞周期较对照组无明显变化(P>0.05)。结论:成功构建了hsa-let-7c过/低表达的牙周膜干细胞模型,hsa-let-7c过/低表达对牙周膜干细胞增殖能力无明显影响。第二部分Hsa-let-7c对牙周膜干细胞IGF-1R表达和成骨分化的影响研究目的:探讨过/低表达hsa-let-7c的牙周膜干细胞IGF-1R蛋白的表达情况以及成骨向分化能力。研究方法:细胞免疫荧光法检测牙周膜干细胞中IGF-1R的表达和分布。hsa-let-7c过/低表达慢病毒载体转染牙周膜干细胞72小时后提取总蛋白和总RNA。Western blot检测hsa-let-7c过/低表达的牙周膜干细胞中IGF-1R蛋白的表达水平以及成骨向分化相关蛋白(OCN,OSX和RUNX2)的变化;Real-time RT-PCR检测成骨向分化相关基因(OCN,OSX和RUNX2)的变化。通过ALP活性检测、茜素红钙结节染色和CPC钙离子浓度测定,分析hsa-let-7c过/低表达的牙周膜干细胞的矿化能力。实验结果:细胞免疫荧光结果显示:IGF-1R主要分布在牙周膜干细胞胞浆和胞膜上。hsa-let-7c过表达组中,实验组较对照组牙周膜干细胞的ALP活性下降,钙结节形成减少,差异具有统计学意义(P<0.05);hsa-let-7c低表达组中,实验组较对照组牙周膜干细胞的ALP活性和钙结节形成情况无显著差异(P>0.05)。Real time RT-PCR结果显示:当hsa-let-7c过表达时,成骨向分化相关基因(OCN,OSX和RUNX2)的表达水平较对照组显著下调(P<0.05);当hsa-let-7c低表达时,成骨向分化相关基因(OCN,OSX和RUNX2)的表达水平与对照组相比无明显差异(P>0.05)。Western blot结果显示:当hsa-let-7c过表达时,IGF-1R表达下调,同时成骨向分化相关蛋白的表达水平(OCN,OSX和RUNX2)均较对照组显著下降(P<0.05);当hsa-let-7c低表达时,IGF-1R表达上调,而成骨向分化相关蛋白的表达水平(OCN,OSX和RUNX2)较对照组无明显差异(P>0.05)。但是hsa-let-7c低表达hPDLSCs和对照组hPDLSCs在经过外源性IGF-1刺激后,let-7c(-)+IGF-1的hPDLSCs其成骨向分化相关蛋白的表达水平较对照组(let-7c(-)Con+IGF-1)升高(P<0.05),同样地,钙化结节形成更多且连成片。结论:IGF-1R主要分布在牙周膜干细胞胞浆和胞膜上。hsa-let-7c反向调控IGF-1R蛋白的表达水平。hsa-let-7c过表达会抑制牙周膜干细胞的成骨分化能力。hsa-let-7c低表达状态下的牙周膜干细胞其成骨向分化进程无明显变化,而IGF-1可以激活hsa-let-7c低表达对成骨分化的促进作用。第三部分Hsa-let-7c对牙周膜干细胞MAPK通路的影响研究目的:探讨MAPK通路在hsa-let-7c调控牙周膜干细胞分化过程中的可能作用。研究方法:hsa-let-7c过/低表达慢病毒载体转染牙周膜干细胞后,提取胞浆胞核蛋白,Western blot 检测 MAPK 通路相关蛋白(p-ERK,ERK,p-JNK,JNK,p-p38,p38)及通路下游相关转录因子Elk1的表达情况。实验结果:MAPK通路相关蛋白Western blot结果显示:p-JNK及JNK蛋白在两组的表达量均无明显差异(P>0.05)。hsa-let-7c过表达时,p-p38和p-ERK蛋白的表达水平较低,p-p38/p38和p-ERK/ERK比值较对照组明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。hsa-let-7c低表达时,p-p38和p-ERK蛋白的表达水平较高,p-p38/p38和p-ERK/ERK比值较对照组明显升高,同时,下游的相关转录因子也被激活,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:MAPK通路在hsa-let-7c调控牙周膜干细胞分化过程中发挥重要作用。