目的化疗后白细胞减少是影响化疗方案执行的重要原因,本课题采用多中心、随机、双盲、双模拟、阳性药物平行对照临床研究设计,以气血两虚证的肺癌、乳腺癌患者为研究对象,以芪胶升白胶囊、安多霖胶囊、化疗为干预措施,监测化疗后全血细胞计数、气血两虚证积分变化,评价芪胶升白胶囊防治化疗相关白细胞减少的疗效;进一步以环磷酰胺诱导的白细胞减少小鼠模型为研究对象,以芪胶升白胶囊为干预措施,通过细胞生物学及分子生物学技术,观察小鼠白细胞计数、脾脏指数、胸腺指数、骨髓增生程度、细胞因子表达等变化,探讨芪胶升白胶囊促进化疗后白细胞复常的机制,为推广中成药辅助治疗肿瘤性疾病提供临床及实验依据。方法1.临床研究:采用多中心、随机、双盲、双模拟、阳性药物平行对照临床研究设计,拟纳入8个中心260例肺癌、乳腺癌具有气血两虚证并拟行化疗的患者,按脱落率不超过20%,拟纳入312例,中央随机按2:1的比例进入观察组(芪胶升白胶囊组)及对照组(安多霖胶囊组)。肺癌患者应用含顺铂/卡铂方案,乳腺癌应用含多西他赛/紫杉醇方案。观察组口服芪胶升白胶囊,对照组口服安多霖胶囊,两组患者均口服包装编盲药物每次4粒,每日3次,两组疗程均为1个化疗周期(20天)。入组前3天填写一般资料,采集血常规、评价气血两虚证积分及安全性指标,化疗第5±1天、10±1天、15±1天、20±1天采集血常规,第20±1天评价气血两虚证积分及安全性。主要疗效指标分别使用FAS、PPS进行统计,次要疗效指标使用PPS进行统计。课题来源于国家科技重大专项项目重大新药创制“苗药芪胶升白胶囊再评价研究”(课题编号:2014ZX09301308007)。本研究已通过本院伦理委员会审查,审批号ECPJ-BDY-2015-09。主要疗效指标为4级、3/4级、1-4级中性粒细胞(NE)下降发生率;次要疗效指标包括白细胞(WBC)及NE最低值、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)使用率、后续化疗延期率、各访视点WBC、NE变化情况及复常率。根据本次化疗的疗程数、基线WBC计数、患者年龄分别进行分层统计,对影响1-4级NE下降发生的相关因素进行逻辑回归分析。气血两虚证积分量化,对气血两虚证候总积分改善率、单项症状改善率、各项症状积分的差值,进行组间及组内比较。2.实验研究:①造模:应用ICR小鼠制备白细胞减少模型。5-6周龄ICR小鼠,腹腔注射环磷酰胺100mg/kg连续给药3天。②分组给药:以白细胞减少模型鼠为研究对象,芪胶升白胶囊为干预措施。将ICR小鼠随机分组,每组10只(5雄5雌),分为模型组、中药低剂量组、中剂量组、高剂量组,正常空白组、正常中药组共6组。中药低、中、高剂量组分别予芪胶升白胶囊0.5、1.0、2.0g/Kg,正常中药组为正常小鼠灌胃芪胶升白胶囊1.0g/Kg,模型组及正常空白组予等体积蒸馏水灌胃,连续17天。各中药组于造模前3天开始灌胃芪胶升白胶囊,除正常两组外,注射环磷酰胺造模。③观察指标:给药第7天开始隔日采集血常规,第17天处死动物,眼眶取血,制备骨髓涂片,称重计算脾指数、胸腺指数,观察骨髓增生程度,ELISA方法检测脾组织IL-2、IL-4、IL-6、GM-CSF以及血清GM-CSF含量,Western Blot法检测脾组织GM-CSF蛋白表达。结果1.临床研究:2016年3月-2018年3月共纳入309例肺癌、乳腺癌具有气血两虚证的患者。观察组及对照组基线资料无明显差异(P>0.05)。(1)主要疗效指标:全数据集(FAS)287例(观察组192例、对照组95例),符合方案集(PPS)共252例(观察组175例、对照组77例)。4级、3/4级、1-4级NE下降率,观察组与对照组,在FAS中分别为14.6%vs15.5%、31.2%vs 31.7%,73.2%vs 73.5%;在 PPS 中分别为 13.4%vs15.5%、29.4%vs 30.5%,71.9%vs 72.7%,FAS 及 PPS 中两组差异均无统计学意义(P>0.05)。FAS中第1周期化疗的患者,4级NE下降率观察组为4.5%,明显低于对照组的37.5%(P<0.05);3/4级NE下降率观察组为13.6%,明显低于对照组的50.0%(P<0.05)。(2)次要疗效指标:①WBC、NE的最低值、G-CSF使用率、后续化疗延期率,观察组与对照组均无明显差异(P>0.05);②在第2周期化疗的患者中,观察组化疗第5±1天的WBC、NE计数(×109/L)分别为(6.29±1.87)、(4.79±1.92),均明显高于对照组(3.75±1.08)、(2.26±0.75),(P<0.01);③头晕眼花症状为化疗后1-4级NE下降的独立危险因素。(3)肺癌单病种分析:纳入肺癌患者168例(观察组114例,对照组54例),FAS中161例(观察组109例,对照组52例),PPS中138例(观察组98例,对照组40例)。4级、3/4级、1-4级NE下降率,观察组与对照组,在FAS中分别为6.6%vs6.1%、28.8%vs25.7%、65.5%vs 68.3%,差异均无统计学意义(P>0.05)。化疗第5±1天,观察组WBC明显高于对照组。NE下降的独立影响因素为KPS评分、头晕眼花症状。(4)乳腺癌单病种分析:纳入乳腺癌141例(观察组96例,对照组45例),FAS中126例(观察组83例,对照组43例),PPS中114例(观察组77例,对照组37例)。4级、3/4级、1-4级NE下降率,观察组与对照组,在FAS中分别为24.6%vs28.0%、34.4%vs40.0%、83.3%vs 81.5%,均无明显差异(P>0.05)。NE回升幅度,观察组明显高于对照组,第3周期及以上化疗者更为突出。≥60岁的患者,观察组WBC降低幅度明显低于对照组,老年患者获益更明显。(5)中医疗效指标,FAS共309例(观察组210例、对照组99例)。PPS共266例(观察组185例、对照组81例)。芪胶升白胶囊能显著改善气血两虚证,避免药毒损耗气血。①两组患者气血两虚证候总积分及各单项症状积分均较治疗前明显降低(P<0.001)。②两组患者气血两虚证候总积分改善率差异无统计学意义(P>0.05)。③观察组心悸失眠症状改善率明显高于对照组(P=0.01)。④基线气血两虚证候总积分≥10分者:观察组心悸失眠症状改善率显著高于对照组(P<0.01);观察组心悸失眠、神疲乏力积分回落幅度优于对照组(P<0.05)。(6)安全性指标:共有309例患者进入安全性分析,观察组210例,对照组99例。①观察组4例患者发生4次,对照组3例患者发生3次,经关联性判定“可能及以上”的人数为0。②HGB稳定率,观察组与对照组分别为81.0%vs81.2%;PLT稳定率,观察组与对照组分别为94.0%vs93.0%,均无明显差异(P>0.05)。2.实验研究:成功建立白细胞减少小鼠模型。60只SPF级ICR小鼠,随机分为6组,每组10只,分别为模型组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、正常空白组、正常中药组。①白细胞计数:中药给药后第7天,模型组、中药低、中、高剂量组、正常空白组、正常中药组白细胞(×109/L)分别为4.03±0.92、3.48±1.71、3.60±1.34、3.91±1.52、9.96±1.94、11.41±3.63,各组与正常空白组比较差异(P<0.05)。给药第15天,中药高剂量组白细胞计数高于模型组,给药第17天,中药中、高剂量组白细胞计数高于模型组(P<0.05)。②骨髓增生程度:以正常空白组为参照,模型组增生程度明显减低,高剂量组骨髓增生程度已接近正常。③脾脏指数、胸腺指数:中药低、中、高剂量组的脾脏指数、胸腺指数均高于模型组(P<0.05)。④脾组织IL-2、IL-4:模型组IL-2、IL-4含量均低于正常空白组及正常中药组(P<0.05);中药高剂量组IL-2、IL-4含量均高于模型组(P<0.05)。⑤脾组织GM-CSF含量:模型组GM-CSF含量明显低于正常空白组及正常中药组(P<0.05);中药中、高剂量组GM-CSF含量(ng/L)分别为0.99±0.14、0.81±0.11,均明显高于模型组0.33±0.05(P<0.01)。Western blot检测中、高剂量组GM-CSF蛋白表达水平明显提高。⑥血清GM-CSF含量:模型组血清GM-CSF含量明显低于正常空白组及正常中药组(P<0.01);中药低、中、高剂量组 GM-CSF 含量(ng/L)分别为 358.75±20.02、350.19±28.28、323.60±34.44,均高于模型组 290.02±43.74(P<0.05)。结论芪胶升白胶囊能有效防治化疗相关白细胞减少,改善气血两虚证,通过调控粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子等提高造血功能,促进化疗后白细胞及中性粒细胞复常。