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斑节对虾（Penaeus monodon）作为我国沿海地区重要的水产经济品种,对于水产养殖经济的发展有着极大的贡献。然而日益恶化的水体环境以及细菌和病毒的肆虐,导致斑节对虾的养殖形势越来越严峻。对虾作为无脊椎动物,其主要依赖先天免疫系统来抵御外界的威胁,维持机体健康。因此,深入了解先天免疫系统的调控机制,对于增强对虾抗病力,提高经济效益,有着重要的作用。凝集素作为先天免系统模式识别受体（pattern recognition receptor,PRR）超家族的重要成员,其中C型凝集素更是具有病原体识别、诱导微生物凝集、调停素作用、吞噬作用等多种功能。其中最为典型的免疫方式是通过识别病原微生物表面暴露的病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular pattern,PAMP）,从而诱导微生物凝集成块,进而被巨噬细胞所吞噬,达到清除病原的目的。除此以外,探索斑节对虾C型凝集素基因在面对氨氮和低盐胁迫时的表达量变化,有助于了解对虾在应对环境胁迫时机体的免疫保护机制。具体实验结果阐述如下:1、斑节对虾新型凝集素基因的分离与鉴定本课题首先从斑节对虾肝胰腺转录组文库中筛选获得C型凝集素的EST序列,通过PCR、RACE和TA克隆等技术,获得斑节对虾新型C型凝集素PmCL1和PmCL2基因全长,Gen Bank登录号分别为:MK076295和MK599468。其中,PmCL1的c DNA全长共861bp,包含5’UTR 74bp,3’UTR 292bp,ORF 495bp,共编码164个氨基酸。包含一个20 Aa的信号肽序列,9个磷酸化位点;PmCL1的分子量为16.17k Da,理论等电点为4.42。PmCL2的c DNA包含5’UTR 165bp的,3’UTR 146bp,以及720bp的ORF,编码239个氨基酸;包含一个16 Aa的信号肽序列,23个磷酸化位点;PmCL2的蛋白预测分子量为24.59k Da,理论等电点为4.75。生物信息学分析表明,PmCL1和PmCL2的结构域极为相似,即只拥有一个信号肽和一个CRD结构域。多重比对结果显示两者均含有6个保守的半胱氨酸残基位点,糖结合motif均为EPS。进化树分析表明PmCL1单独聚为一支,而PmCL2则与秀丽白虾（Palaemom modestus）的C-type lectin 3、罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）的lectin 3聚为一支。2、斑节对虾新型凝集素PmCL1和PmCL2的表达模式分析通过荧光定量实时PCR对PmCL1和PmCL2进行全组织定量。结果显示,两者均在肝胰腺呈现最高表达,其次为鳃、肠、胃等组织,然而在性腺中却几乎检测不到。其次,检测了在胁迫条件下的表达模式,结果显示PmCL1基因在低盐刺激下,其在肝胰腺中呈现波动调节的趋势,而在肠组织中3h呈现下调表达,随后上升并波动往复调节;对于PmCL2,其在肝胰腺和肠组织中,都是在3h被抑制,之后在肝胰腺中虽有上调,但相对于0h仍然处于抑制状态,而在肠组织中,3h之后处于波动状态,直至72h趋于稳定。在氨氮胁迫下,PmCL1在肝胰腺和肠组织中都呈现3h上调,随后下调的趋势,并且在高浓度的氨氮胁迫下,抑制表达的情况越显著;PmCL2在肝胰腺中,随着时间的变化一直处于下调表达,期间虽有上升,相比于0h依然处于被抑制的状态,而在肠组织中,其表达量在3h先上升,之后在缓慢下降。随后检测了在菌刺激下的表达模式,结果显示PmCL1和PmCL2对于革兰氏阴性菌的刺激更为敏感,其表达量都存在先上调后下调的过程。在鳗弧菌的刺激下,PmCL1在鳃组织和肝胰腺中分别在6h和12h表达量最高;在哈维氏弧菌刺激下,在鳃组织中24h表达量呈现最大值,而肝胰腺中从6h至24h都呈现高表达。PmCL2基因在鳗弧菌的刺激下,其在鳃组织和肝胰腺中分别于6h和3h呈现最大值,而在哈维氏弧菌的刺激下,鳃组织最大表达量在3h,肝胰腺中最大表达量在6h。3、斑节对虾新型凝集素PmCL1和PmCL2的蛋白功能特性研究通过原核表达等技术获得PmCL1和PmCL2的重组蛋白,其分子量分别为35.6k D和40.0k D,利用His标签和Ni-NTA树脂进行纯化,获得较纯的原核表达蛋白。通过ELISA方法检测凝集素对病原体相关模式分子（pathogen-associated molecular patterns,PAMP）的结合特性,结果显示,对于脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）和肽聚糖（peptidoglycan,PGN）呈现较好的剂量依赖效应,而对于脂磷壁酸（lipoteichoicacid,LTA）没有结合活性或者结合活性较差;相比之下,r PmCL2。在对rPmCL1结合糖类的结果显示,其能够对多种糖类（甘露糖、葡萄糖、半乳糖、海藻糖、半乳糖胺）呈现相似的结合活性,对葡萄糖（D-glucose）和α-乳糖（α-lactose）具有相似的结合活性,稍强于D型甘露糖（D-mannose）,对于半乳糖胺（galactosamine）和海藻糖trehalose)的结合活性较弱。r PmCL2对于葡萄糖显示出较好的亲和活性,对于海藻糖和半乳糖具有相似的结合活性,而对于D型甘露糖几乎没有结合活性。通过体外细菌凝集实验,发现r PmCL1对于多种细菌均有凝集特性,具有广谱性。竞争性结合实验显示,当添加Ca2+的螯合剂EDTA之后,r PmCL1对于细菌的凝集作用会明显减弱或几乎不发生凝集;当添加PGN为竞争性结合r PmCL1之后,其细菌凝集作用会显著减弱。通过体内注射实验表明,r PmCL1能够显著提高斑节对虾机体对于哈维氏弧菌的清除效率,感染后30min,实验组中虾血淋巴中哈维氏弧菌的数量几乎仅为对照的一半。通过RNA干扰进行基因敲降实验的结果显示,PmCL1和PmCL2基因敲降增加了斑节对虾对哈维氏弧菌的感染敏感性。敲降组中的斑节对虾死亡率都显著增加,尤其是在感染之后1-6 h期间,死亡率陡然上升。ds PmCL1组在12h之后,死亡率仍然继续上升,48h之后略低于80%;而ds PmCL2组中虾死亡率在6h就达到75%,48h之后上升至87%。两个对照组中斑节对虾死亡率48h之后均稳定在60%左右。综合上述实验结果,本课题采用多种技术对斑节对虾新型C型凝集素PmCL1和PmCL2参与先天免疫以及环境胁迫的响应机制有了一定的认识。其作为模式识别受体,分析细菌刺激时表达模式,并对其重组蛋白发挥免疫机制做出相应探究,对研究提高斑节对虾免疫抗病能力奠定理论基础。除此以外,PmCL1和PmCL2在应对氨氮和低盐时的表达模式,初步揭示机体在面临环境胁迫时的免疫保护机制,也一定程度上丰富斑节对虾C型凝集素的功能研究。