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小反刍兽疫(Peste des petits ruminants, PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus, PPRV)引起的一种高度危害性传染病,其主要感染山羊、绵羊,该病的发病率和死亡率都很高。目前主要通过疫苗来预防该病。近年来我国西部地区相继出现几起小反刍兽疫疫情,国家和政府部门高度重视,因此,在现阶段加强对小反刍兽疫的病原学、流行病学等方面的研究具有重要的现实意义。本研究通过表达小反刍兽疫病毒H蛋白,并制备了抗H基因的单克隆抗体,并建立检测小反刍兽疫的间接ELISA检测方法,为深入研究小反刍兽疫病毒奠定了基础。通过RT-PCR方法扩增PPRVH基因,并将其与原核表达载体pET-22b(+)连接,构建重组质粒pET-22b-PPRVH,转化至E.coliBL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE及可溶性分析结果表明pET-22b-PPRVH重组蛋白主要以包涵体的形式表达。纯化重组蛋白并进行Western blot分析,结果表明,该重组蛋白具有很好的反应原性。利用杆状病毒表达系统对小反刍兽疫病毒H基因基因进行表达。构建含有PPRVH基因的转移载体pFB-LIC-Bse-H,并将其转化至E.coli DH10Bac中,并将H基因重组至杆状病毒穿梭载体,将构建好的含有目的基因的重组杆状病毒转染至Sf21昆虫细胞。通过RT-PCR和蛋白免疫印迹技术检测重组杆状病毒目的基因的转录和表达。利用纯化的重组杆状病毒免疫小鼠,可诱导其产生特异性抗体和抗小反刍兽疫病毒中和抗体,淋巴细胞增殖实验检测结果表明重组杆状病毒rBacmid-H能与相应抗体和致敏的效应淋巴细胞发生较强的特异性反应。以浓缩的PPRVNigeria75/1株全病毒蛋白为免疫原,对6-8周龄的雌性BALB/c小鼠进行3次免疫,再以纯化的pET-22b-PPRVH重组蛋白加强免疫。取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,以纯化pET-22b-PPRV H重组蛋白和PPRV作为包被抗原筛选阳性杂交瘤,经三次亚克隆后得到3G3、281和3F5三株单抗细胞株,其中281株为IgG2b型,3F5株和3G3株为IgM型。采用Western blot及间接免疫荧光实验分析杂交瘤细胞分泌抗体能力,结果表明,杂交瘤细胞分泌的抗体能够与重组PPRVH蛋白发生特异性反应,且能够识别Nigeria75/1病毒株全病毒抗原。用纯化的pET-22b-PPRV H重组蛋白包被酶标板,建立间接ELISA方法检测PPRV血清抗体。通过矩阵法优化抗原最佳包被浓度、血清稀释倍数、最佳封闭剂、酶标二抗的最佳稀释度及孵育时间。用建立的间接ELISA方法对92份临床羊血清样本检测,其结果与法国CIRAD-EMVT提供的标准竞争ELISA试剂盒的符合率为94.11%。