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目的:建立骨髓间充质干细胞(MMSC)的单细胞克隆，筛选具有特异性心肌分化潜能的骨髓源性心肌干细胞(MCSC)，研究BMP-2对MCSC向心肌分化的作用及受体信号转导机制。方法:从SD大鼠骨髓中分离MMSC，采用单细胞克隆培养技术，c-kit免疫荧光标记和RT-PCR检测心肌早期转录因子的表达，从MMSC中筛选MCSC。在体外用BMP-2诱导MCSC向心肌定向分化。RT-PCR检测诱导前后BMP-2受体BMPRIA和BMPRII、心肌早期转录因子NKx2．5和GATA-4以及cTnT和Cx-43mRNA的表达。取诱导后不同时间的细胞作cTnT和Cx-43免疫细胞化学染色。用Fluo-3AM标记细胞内Ca2+，在共聚焦激光扫描显微镜下观察细胞内Ca2+水平。取不同发育期和成熟SD大鼠的心肌组织，采用RT-PCR和免疫组织化学染色，检测心肌细胞内cTnT和Cx-43mRNA及其蛋白的表达变化。结果:通过单细胞克隆培养技术，从骨髓中建立了多个MMSC单细胞克隆。c-kit免疫荧光染色显示，c-kit+MMSC克隆大多为成纤维细胞样克隆。RT-PCR检测显示，c-kit+MMSC克隆低表达心肌早期形成转录因子Nkx2．5和GATA-4。从MMSC克隆中筛选出具有心肌特异分化潜能的c-kit+MMSC克隆即为MCSC。在体外，用BMP-2诱导MCSC向心肌分化后，相差显微镜下观察到，从诱导后l周开始细胞的形态和排列发生变化。心肌早期形成转录因子Nkx2．5和GATA-4的表达从诱导后1周开始增加，3～4周表达明显。cTnT和Cx-43mRNA在诱导前的MCSC中未见表达，诱导后1周的细胞开始表达，3～4周表达明显。cTnT和Cx-43蛋白从诱导后2周开始表达，3～4周表达增强。cTnT呈密集的横纹样结构。Cx-43呈颗粒状，诱导后2周分布于细胞膜下，从3周开始逐渐集中分布于相邻细胞连接处。在共聚焦激光扫描显微镜下，可见分化细胞内Ca2+水平呈周期性变化，加入异丙肾上腺素后，细胞内Ca2+水平明显升高，周期性变化加快。大鼠心肌组织的RT-PCR检测结果显示，cTnTmRNA表达自胚胎期第11天开始到成年大鼠不断上升，Cx-43mRNA表达自胚胎期逐渐增加，至出生后7天达高峰，以后逐渐降低，17天后表达趋于稳定。胚胎第14天大鼠的心肌细胞排列不规则，出生后逐渐趋向规则排列。cTnT蛋白的表达从胚胎到成年逐渐增加。Cx-43蛋白在胚胎第14天大鼠主要分布在小梁的心室肌细胞内，第21天见于所有心室肌细胞。Cx-43蛋白呈颗粒状，多位于细胞膜下。出生后Cx-43的表达逐渐增强，幼年时表达最强，成年后表达趋于稳定，主要分布于心肌闰盘处。结论:本实验从MMSC克隆中筛选了具有心肌特异性分化潜能的MCSC，这将为临床干细胞移植治疗心肌梗死提供理想的干细胞来源。BMP-2通过BMP-2受体BMPRIA和BMPRII的介导作用诱导MCSC分化为心肌细胞。用BMP-2诱导后4周细胞的cTnT和Cx-43的表达特征与出生后lO天大鼠心肌细胞的表达特征相类似，表现为成熟心肌的结构特征。