肿瘤坏死因子(TNF α)是一种具有广谱生物学活性的细胞因子，在不影响正常细胞的前提下，于体内外均能杀伤肿瘤细胞并抑制肿瘤细胞的增殖；并且可以通过刺激T细胞，诱导MHC的表达，参与和调控机体的免疫应答、炎症及发热反应[Camussi,1991]。 本研究采用同源克隆的方法，从黑鲷cDNA中获得肿瘤坏死因子(TNF α)全长cDNA序列。该序列含1288核苷酸，可编码253个氨基酸的TNF前体蛋白。它是一种跨膜蛋白，无糖基化位点和信号肽结构。黑鯛TNFα与其它鱼类的TNFα的相似性很高，与其它鱼类TNFα占据进化上独立的分支，与哺乳类TNFα和TNF β源于共同的祖先。基因结构分析显示，该基因含有TNF家族profile和TNF家族的标签序列；在参与TNF α基因二硫键形成的两个半胱氨酸和TNF α三聚体形成的位点高度保守；空间结构模拟显示，它与哺乳类TNFα的空间结构相似，都是由两个β折叠片组成，每个折叠片包含五个反向平行的β链。表达研究结果表明，黑鯛TNFα在检测的各个组织中均为组成型表达，表现为在刺激与非刺激鱼体中，都可以检测到黑鲷TNFα的表达，但是其表达水平在不同组织中有很大差异。黑鲷TNFα在头肾、脾脏和鳃的表达量较高，而在心脏、肝脏、血液、肾脏和大脑中表达量较低。 为进一步研究黑鲷肿瘤坏死因子的生物学功能，将黑鯛肿瘤坏死因子(TNFα)基因的成熟肽区域亚克隆到表达载体pQE30中，并转化到大肠杆菌XL1-blue中进行表达。转化子经载体和基因特异性引物进行PCR双向筛选，并将筛选到的阳性克隆经质粒纯化后，进行序列测定。序列测定结果显示，该基因结构正确，且准确地插入到表达载体启动子的下游，获得了结构和组成正确的重组子。重组子经IPTG诱导后，以SDS-PAGE电泳鉴定，电泳结果表明，该基因在大肠杆菌XL1-blue中实现了表达。不同诱导时间对重组蛋白影响实验显示，随诱导时间的增加，重组蛋白产量逐渐增高，经4h诱导，其表达量可以达到平台期，继续培养，rTNFα的表达并不显著增高。重组蛋白经镍金属亲和层析纯化，获得了纯度较高的重组蛋白。采用交换缓冲液的方法，用Sephadex G150，对重组蛋白进行脱盐复性，使重组蛋白得到了进一步纯化。同时，可溶性的rTNF重组蛋白也可在自然条件下进行纯化。