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目的:脂代谢紊乱、慢性炎症、过度的氧化应激是动脉粥样硬化(As)、脂肪肝等代谢性疾病发生发展的主要因素。循环中的HDL在改善机体脂质紊乱,促进胆固醇流出,抗炎抗氧化等方面扮演重要角色。当机体一直处于脂代谢紊乱、慢性炎症条件下,循环中与As有关分子的结构和功能受损,如HDL失功能。失功能HDL则可抑制胆固醇逆向转运,促进系统和血管炎症,加剧氧化应激,进而加速了 As的进程。甲硫氨酸亚砜还原酶A(MsrA)是胞内重要的抗氧化酶,我们前期在apoE基因敲除小鼠(apoE-/-)肝脏高表达MsrA,证实了 MsrA能降低肝脏脂质沉积,降低血脂水平,改善氧化炎症状态,延缓了 apoE-/-小鼠As进程。本实验拟借助一种与HDL结合的分泌型多肽—Epk,构建Epk-MsrA重组慢病毒载体,在清道夫受体BI型(SR-BI)基因敲除(SR-BI-/-)小鼠中高表达,旨在探讨Epk-MsrA对循环中HDL相关蛋白分子的修复作用及对小鼠的脂质紊乱、高炎高氧化状态的影响。方法:利用实验室已有质粒 PUC-signal peptide histag-EPK 和 pWPI-GFP-MsrA,构建重组质粒pWPI-GFP-Epk和pWPI-GFP-Epk-MsrA。细胞实验中,将pWPI-GFP-Epk-MsrA 转染 293T 细胞,Western blotting 验证培养基中 Epk-MsrA蛋白的分泌表达,进一步分别将pWPI-GFP、pWPI-GFP-Epk和pWPI-GFP-Epk-MsrA与包装质粒以脂质体法共转染293T细胞,包装、浓缩获得慢病毒颗粒Lv-GFP、Lv-GFP-Epk和Lv-GFP-Epk-MsrA。动物实验:将24只SR-BI-/-小鼠随机分成三组,将慢病毒颗粒经球后静脉注射入SR-BI-/-小鼠体内,注射2周后,给予高脂饮食加速脂代谢紊乱状态,高脂饮食12周后,小鼠进行安乐死、取材分析。期间每隔3-4周监测体重,麻醉状态下球后静脉采血,分离血浆。采用酶法试剂盒测定血浆胆固醇(TC)、游离胆固醇(FC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的水平;快速蛋白液相层析(FPLC)检测血浆脂蛋白胆固醇分布;检测血浆超氧化物歧化酶(SOD)、血浆髓过氧化物酶(MPO)活性;以对氧磷为底物,连续动态检测血浆对氧磷酶(PON1)活性,反映HDL氧化状态;以对硝基苯基丁酸为底物,生成硝基苯酚产物量检测血浆卵磷脂胆固醇酯酰转移酶(LCAT)活性,反映HDL代谢状况;测定血浆谷丙转氨酶(ALT)水平反映小鼠肝功能状态。同时,利用肝脏冰冻切片和血浆Western blotting验证Epk-MsrA高表达;组织化学法检测肝脏脂质沉积,并通过肝脏脂质抽提后测定肝脏脂质含量。Western Blotting测血浆中SAA、A1AT和apoAIV蛋白水平,以反映血浆中的氧还状态。实时荧光定量PCR检测小鼠肝脏脂代谢及炎症相关基因的mRNA水平。结果:重组质粒pWPI-GFP-Epk和pWPI-GFP-Epk-MsrA经DNA测序验证构建成功。质粒pWPI-GFP-Epk-MsrA转染293T细胞,可观察到Epk-MsrA重组蛋白成功高表达并分泌到培养基中。动物实验中,利用慢病毒颗粒Lv-GFP、Lv-GFP-Epk和Lv-GFP-Epk-MsrA感染SR-BI-/-小鼠,高脂12周安乐死后,肝脏切片荧光观察和血浆FPLC组分检测证实Epk-MsrA可分泌入血浆并与HDL结合。三组小鼠体重和ALT活性均无差异。Lv-GFP-Epk组和Lv-GFP-Epk-MsrA组的脾重较对照组明显降低;Lv-GFP-Epk组和Lv-GFP-Epk-MsrA组小鼠血浆TC含量不变而FC和TG 水平下降(p<0.05),HDL-C均显著增加(p<0.05);血浆PON1活性和LCAT活性明显均显著上升(p<0.01),Lv-GFP-Epk-MsrA组MPO活性及SAA蛋白水平明显下降(p<0.05),HDL主要蛋白组分apoAI含量明显增加(p<0.05),而apoAIV和A1AT蛋白水平显著降低(p<0.05)。肝脏油红及HE染色显示,Lv-GFP-Epk组和Lv-GFP-Epk-MsrA组均较对照组小鼠的肝脏脂质沉积降低,肝脏脂质抽提也显示TC不变而FC及TG下降(p<0.05);对肝脏相关基因mRNA表达水平检测发现,Lv-GFP-Epk组和Lv-GFP-Epk-MsrA组FASN表达显著降低(p<0.05),ACAT、LXRα、ABCG8及PONI表达均明显上升(p<0.05),而炎症因子TNFα和IL-6表达均显著降低(p<0.05),且ACAT、LXRα、ABCA1的蛋白表达水平也显著增加(p<0.05)。结论:我们利用HDL结合的Epk成功设计并构建了 pWPI-GFP-Epk-MsrA慢病毒载体,通过感染SR-BI-/-小鼠使Epk-MsrA在体内分泌表达并特征性结合于HDL,从而显著提高循环系统的抗氧化活性,降低炎症水平,改善SR-BI-/-小鼠的HDL代谢紊乱及功能,并显著降低肝脂肪变程度。