肺癌占世界恶性肿瘤死亡首位,其中80%-85%为非小细胞肺癌(NSCLC),传统治疗效果不理想。近年研究表明,表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)与肺癌发生发展相关。针对这一受体的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)吉非替尼和厄洛替尼,已在临床上显示其对EGFR敏感突变(19外显子缺失或21外显子L858R点突变)患者有特别的疗效,具敏感突变的患者其TKI疗效明显优于一线标准化疗方案。但是TKI在临床上最大的问题是其耐药性,通常服药6-12月后几乎所有的患者都会不可避免的会发生耐药,如何克服耐药是目前临床上最主要难题。目前已知的耐药机制包括：T790M突变,约占50%；c-MET扩增,约占20%；其他如HGF表达上升和不明原因耐药约占30%。同时研究发现T790M突变和c-MET扩增均是一个克隆选择的过程,意味着敏感突变患者体内本身存在着耐药突变。一般来讲克服耐药可以从两个方面考虑：第一,从耐药机制本身寻求突破,如第二代不可逆TKI如BIBW等用于T790M突变患者；c-MET扩增可用c-MET抑制剂等。目前的研究基本集中在这一方面,且处于临床前评价阶段。第二,突破耐药机制本身寻求新的靶标克服耐药,而mTOR正是基于此点考虑的潜在分子靶标。mTOR信号通路本身就是EGFR三条超级信号通路中的一条(PI3K-Akt-mTORCl, Erk和STAT3通路),因其控制细胞周期相关蛋白的翻译而成为一个关键的节点,同时Erk和Jak-STAT3通路也直接或间接影响mTOR活性。研究发现多种肿瘤中mTOR信号通路常常异常活化,因此针对mTOR分子的靶向治疗正成为研究的热点。但是目前mTOR抑制剂(雷帕霉素及其类似物包括RAD001)在肿瘤中的疗效较弱且不确切,限制了其在临床上的应用。mTOR在体内形成两种复合物,mTORC1和mTORC2。雷帕霉素及类似物仅仅间接抑制mTORC1的部分功能,且多项研究证实mTORC2在细胞的生长和增殖过程中也发挥重要的作用。EGFR TKI敏感细胞和耐药NSCLC细胞信号通路活化有无差异?mTORC2是否参与NSCLC细胞的生长和增殖及mTORC1和mTORC2激酶活性在敏感和耐药细胞中有无差异?靶向mTOR而非mTORC1在NSCLC细胞中能否取得较好的抗肿瘤效果等目前均不太清楚。本研究体外系统性比较了基础状态下不同的EGFR突变的NSCLC细胞株信号通路的差异及mTORC1和mTORC2激酶活性差异；评价新型的ATP-竞争性mTOR抑制ku-0063794的对非小细胞肺癌细胞的抗增殖效应及对细胞周期的影响。同时在EGFR TKI敏感和耐药的人肺腺癌组织中验证了p-STAT3在细胞株中的表达和细胞定位。第一章EGFR TKI敏感和耐药NSCLC细胞信号通路差异研究方法本研究选择四种不同类型的NSCLC细胞株：PC9细胞(EGFR19外显子缺失,EGFR TKI敏感),PC9GR细胞(吉非替尼诱导耐药细胞),H1650细胞(EGFR19外显子缺失,EGFR TKI耐药)及H1975细胞(EGFR21外显子L858R点突变及T790M突变)作为实验细胞模型。通过Western Blot分析基础状态下四种细胞EGFR三条信号通路(PI3K-Akt-mTOR,ERK及STAT3)相关分子的活化状态；通过免疫沉淀体外分析mTORC1和nTORC2在四种细胞中的活性及通过激光共聚焦显微镜分析磷酸化STAT3在细胞中的定位。结果1基础状态下EGFR TKI敏感和耐药非小细胞肺癌细胞具有不同的信号通路活化状态。Western blot分析显示敏感细胞和耐药细胞均有较高的mTOR、 Rictor和Raptor蛋白表达,Rictor和Raptor蛋白分别为mTORC2和mTORC1的核心分子,显示敏感细胞和耐药细胞中两种mTOR复合物均有较高表达。随后检测基础状态下mTOR相关信号通路Akt ser473、Foxol、p70S6K和4E-BP1的总蛋白和磷酸化表达水平及Erk通路Erkl/2总蛋白及磷酸化表达水平和STAT3信号通路STAT3磷酸化水平,研究发现EGFR TKI耐药细胞mTORC2相关的信号通路和Erk通路活化水平明显高于敏感细胞,而STAT3通路则在敏感细胞和T790M突变耐药细胞中异常活化。2EGFR TKI敏感和耐药的非小细胞肺癌细胞基础状态下体外mTORC1/mTORC2的激酶活性检测显示EGFRTKI耐药细胞nTORC2激酶活性明显高于EGFR TKI敏感细胞,而mTORC1激酶活性在敏感细胞中明显高于耐药细胞。3基础状态下EGFR TKI敏感和耐药非小细胞肺癌细胞STAT3信号通路有差异。基础状态下PC9敏感细胞P-STAT3表达水平最高,耐药细胞株H1975(EGFR exon21L858R+T790M)表达水平次之,而另外两种耐药细胞PC9GR细胞和H1650细胞表达最低。通过激光共聚焦显微镜检测P-STAT3在细胞中的定位发现,基础状态下PC9敏感细胞和H1975耐药细胞的P-STAT3基本都在细胞核中分布,而耐药H1650细胞和PC9GR细胞则基本上在细胞浆中分布。结论本研究证实基础状态下EGFR TKI敏感和耐药的非小细胞肺癌细胞具有不同的mTOR相关的信号通路、Erk及Jak-STAT3信号通路活化状态。耐药细胞mTORC2相关的信号通路活化明显高于敏感细胞,且基础状态下]mTORC2激酶活性耐药细胞中也明显高于敏感细胞。而mTORC1激酶活性在敏感细胞中则较耐药细胞高,显示不管是敏感细胞还是耐药细胞,其mTOR相关信号通路均处于高活化状态,敏感细胞偏向于mTORC1相关信号通路活化,而耐药细胞则偏重于mTORC2相关通路异常活化,显示mTORC2和mTORC1之间存在动态平衡。研究还证实STAT3信号通路在敏感细胞和带有T790M突变的耐药细胞H1975细胞中异常活化。本研究提示mTOR相关信号通路异常活化可能在EGFR突变非小细胞肺癌发生发展中扮演一个重要的角色,为下一步靶向mTOR的研究提供了很好的实验基础。第二章非小细胞肺癌细胞靶向mTOR抗增殖效应的研究方法采用MTT增殖抑制实验测定新型mTOR抑制剂对PC9细胞、PC9GR细胞、H1650细胞和H1975细胞抑制的IC50值。通过western blot方法分析药物的抗增殖机制。流式细胞术检测药物对细胞周期的影响及H1975细胞中采用小RNA干扰Rictor, western blot分析其干扰效应。通过免疫组织化学分析人肺腺癌EGFRTKI敏感和耐药肿瘤标本P-STAT3在肿瘤组织中的表达和细胞定位。结果1MTT抗增殖实验明确了新型mTOR抑制剂ku-0063794对四种非小细胞肺癌细胞株PC9细胞、PC9GR细胞、H1650细胞及H1975细胞抑制的IC50值,四种细胞株IC50值组间差异有统计学意义,F=18.64,P=0.001。用LSD法进行两两比较显示敏感细胞PC9细胞的IC50值与PC9GR和H1650细胞的IC50值有统计学差异,P值分别为0.001和0.009。PC9和H1975细胞IC50值之间比较无统计学差异,P值为0.218。IC50浓度ku-0063794处理细胞后流式细胞术检测周期实验显示IC50浓度ku-0063794能够有效阻滞EGFR TKI敏感和耐药非小细胞肺癌细胞株周期于G1期。2Western blot分析IC50浓度下的ku-0063794细胞抗增殖效应,结果显示ku-0063794能够有效抑制敏感和耐药细胞mTOR磷酸化表达水平,进一步的抗增殖效应分析显示IC50浓度的ku-0063794深度抑制p70S6K蛋白磷酸化表达,一定程度上抑制Foxol磷酸化表达水平,同时药物处理后Akt ser473磷酸化表达水平未见上调。3H1975细胞中通过Rictor蛋白小RNA干扰靶向mTORC2的实验显示有效干扰Rictor蛋白表达,能够有效抑制H1975细胞Foxol蛋白的磷酸化表达水平。4临床EGFR TKI敏感和耐药肺腺癌组织标本P-STAT3免疫组织化学实验与细胞学实验蛋白表达及细胞定位相验证,结果显示EGFR TKI敏感的肿瘤组织和EGFR敏感TKI耐药带有T790M突变肿瘤组织P-STAT3高表达,且定位于细胞核中。5临床EGFR TKI敏感和耐药肺腺癌组织标本p70S6K蛋白免疫组织化学实验证实EGFR突变患者总的和磷酸化的p70S6K蛋白均较高表达,ku-0063794能够深度抑制其磷酸化,显示p70S6K总蛋白或磷酸化蛋白可作为ku-0063794疗效预测因子。结论本研究证实四种敏感和耐药的非小细胞肺癌细胞株均对新型的mTOR抑制剂ku-0063794敏感,其对药物的IC50值统计学分析显示ku-0063794对耐药PC9GR和H1650细胞抗增殖效应更敏感,而对敏感细胞PC9细胞和耐药细胞H1975细胞作用稍弱。基础状态下P-STAT3在敏感细胞和耐药细胞中的表达和细胞定位显示PC9细胞和H1975细胞STAT3信号通路明显活化,考虑这可能是mTOR抑制剂抑制效应差异的一个原因。同时人EGFR TKI敏感和耐药肺腺癌肿瘤组织标本P-STAT3免疫组织化学实验结果验证了细胞学实验结果IC50值浓度下的ku-0063794能够导致EGFR TKI敏感和耐药非小细胞肺癌细胞细胞周期G1期阻滞。Western blot分析结果显示ku-0063794能够有效抑制细胞mTOR磷酸化水平的表达,IC50浓度下能够深度抑制mTORC1底物p70S6K的磷酸化表达水平。同时能够阻断S6K1-IRS-PI3K的负反馈抑制环,一定程度上抑制Akt ser473-Foxol通路。H1975细胞RNA干扰靶向mTORC2实验显示有效干扰Rictor蛋白表达,能够有效抑制H1975细胞Foxol蛋白的磷酸化表达水平,证实mTORC2对Aktser473-Foxol信号通路正向调控作用。全文结论本文系统性的比较了多种不同EGFR TKI敏感和耐药非小细胞肺癌细胞株EGFR三条超级信号通路(PI3K-Akt-mTORC1/mTORC2、Erk和STAT3)基础状态下活化情况,研究发现耐药细胞株中mTORC2相关蛋白异常活化,进一步研究证实耐药细胞中其mTORC2激酶活性明显上调,而敏感细胞中则是mTORC1激酶活性上调,显示mTORC1和mTORC2之间存在动态平衡,从另外一个方面说明为什么单独抑制mTORCl抗肿瘤疗效欠佳。敏感细胞PC9细胞和耐药细胞H1975细胞STAT3信号通路基础状态下明显活化,提示STAT3信号通路的活化状态有可能决定mTOR抑制剂的抗增殖差异。随后的ku-0063794抗增殖实验结果也这一推测相符,实验显示ku-0063794处理PC9细胞和H1975细胞达到IC50值需要更高浓度。MTT抗增殖实验和细胞学实验显示P-STAT3表达和细胞定位与mTOR抑制剂抑制效应之间存在某种形式的关联。同时临床EGFR TKI敏感和耐药肺腺癌肿瘤组织标本P-STAT3免疫组织化学检测也证实EGFR TKI敏感肿瘤组织和带有T790M突变耐药组织其P-STAT3表达高,且定位于肿瘤细胞核中,从临床标本上验证了我们细胞学实验。mTOR抑制剂抑制效应分析显示ku-0063794能够诱导EGFR TKI敏感和耐药非小细胞肺癌细胞细胞周期G1期阻滞。相关信号通路分子检测发现ku-0063794能够有效抑制细胞mTOR磷酸化水平的表达,深度抑制mTORC1底物S6K1的磷酸化表达水平。同时能够阻断S6K1-IRS-PI3K的负反馈抑制环,IC50浓度的ku-0063794不能完全阻断Akt ser473-Foxol通路。H1975细胞中靶向mTORC2的RNA干扰实验显示Akt ser473-Foxol信号通路受mTORC2正向调控,证实mTORC2对非小细胞肺癌生长和增殖发挥重要作用。