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背景及目的
保存牙髓活力对维持乳牙的功能及恒牙的正常替换至关重要。活髓切断术是常用的保存活髓方法，盖髓材料发挥隔绝外界刺激、诱导牙髓干细胞分化、促进修复性牙本质形成的重要作用。生物活性玻璃(Bioactive glass，BG)具有优异的生物活性及骨诱导性能，在体液中可溶出硅、钙、磷等离子，诱导牙髓干细胞成牙本质方向分化，促进硬组织再生，适用于牙髓-牙本质修复领域。目前关于生物活性玻璃对乳牙牙髓干细胞(Stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)生物学效应的报道较少。临床应用中，盖髓材料常暴露于细菌或炎症所产生的酸性环境，而酸性环境可能会影响材料的理化性能。因此，本研究拟探索BG在模拟酸性条件下的离子释放性能以及酸碱缓冲性能，进一步探索含不同硅浓度的亚微米级BG浸提液对SHED成牙本质分化和矿化作用的影响，为其应用于乳牙活髓保存治疗提供一定的理论依据。
材料与方法
第一部分：亚微米生物活性玻璃的材料性能研究
扫描电子显微镜观察BG的表面形貌及超微结构，X射线能量色散谱仪分析其元素组成及含量。将BG粉末与含海藻酸钠的磷酸盐缓冲液拌和，得到膏状混合物，分别置于丁酸-磷酸盐缓冲液(pH 5.4)和磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，浸泡不同的时间后检测溶液的pH值，电感耦合等离子发射光谱仪检测上清液中硅、钙、磷等离子的浓度。
第二部分：亚微米生物活性玻璃的体外成牙本质作用研究
从人类的滞留乳牙中分离出牙髓组织，酶消化法得到牙髓细胞，第3-6代细胞用于以下实验研究。配制含0.1、0.5、2.5g/L(mg/mL)BG浸提液的DMEM培养基，电感耦合等离子发射光谱仪检测培养液中硅、钙、磷等离子的浓度，根据硅离子浓度将BG分为低硅浓度组、高硅浓度组，对照组为DMEM培养基组。通过CCK-8法研究BG浸提液对SHED增殖能力的影响，通过碱性磷酸酶染色及定量检测评估BG浸提液作用后SHED成牙本质分化能力，Real-timePCR检测成牙本质分化相关基因ALP、COLI、DSPP的表达，Westernblot检测DSPP的蛋白表达水平，茜素红钙化结节染色及氯化十六烷基吡啶半定量法分析BG对SHED矿化能力的影响，拉曼光谱对比BG诱导后SHED产生的矿化产物与天然乳牙牙本质间生化成分的差异。
结果
第一部分：亚微米生物活性玻璃的材料性能研究
扫描电子显微镜显示，BG呈规则的球形，具有良好的单分散性，粒径约为300~500nm。X射线能量色散谱仪显示，BG由大量的硅以及少量的钙和磷组成。在中性环境(pH 7.4)中，相同的时间内BG溶出的硅离子比酸性环境(pH 5.4)多，且pH值在48h内达到平台期(pH值9.32±0.07)，酸性环境下BG浸出液的pH值在24h内达到7.13，呈中性。
第二部分：亚微米生物活性玻璃的体外成牙本质作用研究
电感耦合等离子发射光谱仪检测可得，DMEM培养基的硅含量极微，0.1、0.5、2.5g/LBG浸提液的硅离子浓度分别为15.46±0.77、54.64±4.42、92.75±2.49mM，差异有统计学意义(P＜0.05)，0.1、0.5g/LBG组为低硅浓度组，2.5g/LBG组为高硅浓度组。CCK-8结果显示0.1g/LBG组的细胞增殖与对照组无统计学差异(P＞0.05)，0.5、2.5g/LBG组的细胞增殖低于对照组(P＜0.05)。低硅浓度组的细胞ALP活性显著高于高硅浓度组和对照组(P＜0.05)，低硅浓度组显著促进ALP、COLI、DSPP矿化相关基因的表达(P＜0.05)。不同硅浓度的BG组均促进DSPP的蛋白表达(P＜0.05)。成骨诱导14d后，不同硅浓度的BG组较对照组形成更多矿化结节，半定量分析显示低硅浓度组的钙化量最高(P＜0.05)。拉曼光谱结果显示BG体外诱导SHED形成的矿化结节与天然乳牙牙本质具有相似的光谱特征及矿物/基质比(P＞0.05)，但SHED产生一种高碳酸盐取代程度的矿化基质(P＜0.05)。
结论
酸性环境可降低亚微米生物活性玻璃的离子释放及酸中和的速度，但可以满足临床炎症酸性环境对盖髓材料的要求。低硅浓度的亚微米生物活性玻璃不影响乳牙牙髓干细胞的增殖，可促进其成牙本质分化和矿化作用，作为促进牙髓-牙本质再生的潜在材料。
保存牙髓活力对维持乳牙的功能及恒牙的正常替换至关重要。活髓切断术是常用的保存活髓方法，盖髓材料发挥隔绝外界刺激、诱导牙髓干细胞分化、促进修复性牙本质形成的重要作用。生物活性玻璃(Bioactive glass，BG)具有优异的生物活性及骨诱导性能，在体液中可溶出硅、钙、磷等离子，诱导牙髓干细胞成牙本质方向分化，促进硬组织再生，适用于牙髓-牙本质修复领域。目前关于生物活性玻璃对乳牙牙髓干细胞(Stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)生物学效应的报道较少。临床应用中，盖髓材料常暴露于细菌或炎症所产生的酸性环境，而酸性环境可能会影响材料的理化性能。因此，本研究拟探索BG在模拟酸性条件下的离子释放性能以及酸碱缓冲性能，进一步探索含不同硅浓度的亚微米级BG浸提液对SHED成牙本质分化和矿化作用的影响，为其应用于乳牙活髓保存治疗提供一定的理论依据。
材料与方法
第一部分：亚微米生物活性玻璃的材料性能研究
扫描电子显微镜观察BG的表面形貌及超微结构，X射线能量色散谱仪分析其元素组成及含量。将BG粉末与含海藻酸钠的磷酸盐缓冲液拌和，得到膏状混合物，分别置于丁酸-磷酸盐缓冲液(pH 5.4)和磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中，浸泡不同的时间后检测溶液的pH值，电感耦合等离子发射光谱仪检测上清液中硅、钙、磷等离子的浓度。
第二部分：亚微米生物活性玻璃的体外成牙本质作用研究
从人类的滞留乳牙中分离出牙髓组织，酶消化法得到牙髓细胞，第3-6代细胞用于以下实验研究。配制含0.1、0.5、2.5g/L(mg/mL)BG浸提液的DMEM培养基，电感耦合等离子发射光谱仪检测培养液中硅、钙、磷等离子的浓度，根据硅离子浓度将BG分为低硅浓度组、高硅浓度组，对照组为DMEM培养基组。通过CCK-8法研究BG浸提液对SHED增殖能力的影响，通过碱性磷酸酶染色及定量检测评估BG浸提液作用后SHED成牙本质分化能力，Real-timePCR检测成牙本质分化相关基因ALP、COLI、DSPP的表达，Westernblot检测DSPP的蛋白表达水平，茜素红钙化结节染色及氯化十六烷基吡啶半定量法分析BG对SHED矿化能力的影响，拉曼光谱对比BG诱导后SHED产生的矿化产物与天然乳牙牙本质间生化成分的差异。
结果
第一部分：亚微米生物活性玻璃的材料性能研究
扫描电子显微镜显示，BG呈规则的球形，具有良好的单分散性，粒径约为300~500nm。X射线能量色散谱仪显示，BG由大量的硅以及少量的钙和磷组成。在中性环境(pH 7.4)中，相同的时间内BG溶出的硅离子比酸性环境(pH 5.4)多，且pH值在48h内达到平台期(pH值9.32±0.07)，酸性环境下BG浸出液的pH值在24h内达到7.13，呈中性。
第二部分：亚微米生物活性玻璃的体外成牙本质作用研究
电感耦合等离子发射光谱仪检测可得，DMEM培养基的硅含量极微，0.1、0.5、2.5g/LBG浸提液的硅离子浓度分别为15.46±0.77、54.64±4.42、92.75±2.49mM，差异有统计学意义(P＜0.05)，0.1、0.5g/LBG组为低硅浓度组，2.5g/LBG组为高硅浓度组。CCK-8结果显示0.1g/LBG组的细胞增殖与对照组无统计学差异(P＞0.05)，0.5、2.5g/LBG组的细胞增殖低于对照组(P＜0.05)。低硅浓度组的细胞ALP活性显著高于高硅浓度组和对照组(P＜0.05)，低硅浓度组显著促进ALP、COLI、DSPP矿化相关基因的表达(P＜0.05)。不同硅浓度的BG组均促进DSPP的蛋白表达(P＜0.05)。成骨诱导14d后，不同硅浓度的BG组较对照组形成更多矿化结节，半定量分析显示低硅浓度组的钙化量最高(P＜0.05)。拉曼光谱结果显示BG体外诱导SHED形成的矿化结节与天然乳牙牙本质具有相似的光谱特征及矿物/基质比(P＞0.05)，但SHED产生一种高碳酸盐取代程度的矿化基质(P＜0.05)。
结论
酸性环境可降低亚微米生物活性玻璃的离子释放及酸中和的速度，但可以满足临床炎症酸性环境对盖髓材料的要求。低硅浓度的亚微米生物活性玻璃不影响乳牙牙髓干细胞的增殖，可促进其成牙本质分化和矿化作用，作为促进牙髓-牙本质再生的潜在材料。