咳嗽变异性哮喘(CVA)是慢性咳嗽的主要病因之一,其发病率高,病情容易反复,严重影响患者的生活质量。CVA与典型支气管哮喘有相似的病理生理特征,目前指南推荐吸入糖皮质激素/β受体激动剂(ICS/LABA)作为CVA首选治疗。但由于治疗周期长,部分患者对吸入激素存在抵触心理,治疗依从性不佳,导致咳嗽症状得不到有效控制。也有研究证实,即使规范吸入ICS/LABA后症状能得到有效控制,但一旦停药,咳嗽症状、肺功能、气道炎症可出现再次加重,故停药或中断用药被认为是不明智的选择。因此,CVA的治疗在有效缓解症状的同时,如何减少吸入用药的使用,减少停药导致的咳嗽症状、肺功能、气道炎症再次加重,是研究更应关注的问题。中医诊治咳嗽有着悠久的历史。目前多数医家将其归于“风咳”范畴,采用疏风宣肺治法。我们在临证中的发现,CVA临床表现除明显的“风”性特点外,还具有“虚”“寒”的特征,因此,提出在疏风宣肺的同时,宜配合温肺之法,并拟定了温肺疏风方。前期临床观察发现,在吸入ICS/LABA的基础上联合温肺疏风方治疗,很多CVA患者症状可以得到长期改善,咳嗽症状复发率减少,从而减少了 ICS/LABA的使用。由此,我们认为温肺疏风方联合ICS/LABA治疗CVA的优势可能体现在减少复发,持续改善症状、肺功能及气道炎症反应等方面。为证之,本研究将通过一项随机、双盲、安慰剂对照试验评价温肺疏风方的临床疗效,通过网络药理学的方法筛选温肺疏风治疗CVA的可能通路,并开展实验研究,探讨温肺疏风方治疗CVA的分子作用机制。目的:1.通过一项随机、双盲、安慰剂对照试验,客观评价温肺疏风方治疗CVA的有效性和安全性,明确其在CVA治疗中的优势。2.通过网络药理学方法,筛选温肺疏风方治疗CVA可能的途径,为开展相关机制研究提供理论依据。3.以网络药理学筛选通路为切入点,通过动物实验探讨温肺疏风方治疗CVA的作用机制。方法:1.采用随机、双盲、安慰剂对照试验设计,以广东省中医院呼吸科及甄氏流派门诊诊断为CVA的患者为研究对象,观察比较试验组(口服温肺疏风方颗粒剂联合沙美特罗替卡松粉吸入)与对照组(口服温肺疏风方颗粒剂安慰剂联合沙美特罗替卡松粉吸入)治疗后4周、8周、12周、停药后12周、24周各时点咳嗽视觉模拟评分、莱塞斯特咳嗽生活质量总评分,比较两组治疗后12周、停药后12周、24周肺功能相关指标,比较两组停药后12周、24周咳嗽症状累积复发率、复发患者重新抗炎治疗率,并对温肺疏风方进行安全性评价。2.通过TCMSP数据库查询温肺疏风方有效化学成分及其对应靶点,通过Disgenet、OMIM、Drugbank、KEGG数据库查询哮喘相关靶点,将温肺疏风方作用靶点与哮喘靶点进行映射,得出温肺疏风方可能作用于哮喘的靶点,将映射靶点利用String平台构建温肺疏风方作用于哮喘的体内反应网络图,根据蛋白蛋-白相互作用评分进行筛选,通过Cytoscape软件进行网络拓扑分析,获得温肺疏风方作用哮喘的关键靶点。利用DAVID数据库对映射所得的靶点进行KEGG信号通路富集分析,获得温肺疏风方作用于哮喘的可能通路。综合分析温肺疏风方作用于哮喘的关键靶点及通路富集结果,选取与哮喘相关性大的信号通路进行动物实验验证。3.采用卵清蛋白(OVA)腹腔注射致敏加雾化激发的方式构建小鼠哮喘模型,实验小鼠随机分为4组:正常组、模型组、地塞米松组、温肺疏风方组,每组8只。模型组、地塞米松组、温肺疏风方组在实验第0、6、12天分别给予OVA和氢氧化铝混合液腹腔注射致敏,正常组给予磷酸盐缓冲液(PBS)腹腔注射。模型组、地塞米松组、温肺疏风方组在实验第18-31天给予OVA雾化激发,每次激发40min。正常组给予PBS雾化激发40min。温肺疏风方组每次激发前1h用温肺疏风方颗粒剂按2.55g/kg灌胃;地塞米松组每次激发前1h用地塞米松注射液按2.5mg/kg腹腔注射;正常组及模型组每次激发前1h用生理盐水0.5ml灌胃。观察雾化激发时各组小鼠表现,治疗结束后48小时内各组小鼠行有创肺功能检测气道阻力;收集小鼠支气管肺泡灌洗液,离心后上清液用于ELISA检测,细胞沉淀重悬后涂片行炎症细胞分类计数;采用HE染色方法观察肺组织病理改变,采用PAS染色观察气道上皮杯状细胞增生情况;采用ELISA方法检测支气管肺泡灌洗液中炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β的含量;采用Real-time PCR检测肺组织中TLR4-NF-κ B/MAPK信号通路上关键靶点TLR4、NF-κBp65、p38MAPK、Erk1/2、JNK mRNA 表达水平,采用 Western Blot 检测TLR4、p-NF-K Bp65、p-p38MAPK、p-Erk1/2、p-JNK 蛋白表达水平。结果:1.临床试验共纳入受试者80例,剔除4例,意图治疗(ITT)分析纳入76例,依从方案受试者(PPS)分析纳入57例。ITT分析和PPS分析结果一致,(1)咳嗽视觉模拟评分分析:两组治疗后4周、8周、12周、停药后12周、24周咳嗽视觉模拟评分相比,差异无统计学意义(P>0.05)。组内治疗后各时点与治疗前比较,咳嗽视觉模拟评分均明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)咳嗽症状累积复发率分析:两组停药后24周、12周咳嗽症状累积复发率相比,差异无统计学意义(P>0.05)。试验组有降低停药后24周复发率的趋势(试验组:36.0%,对照组:59.4%)。(3)复发患者需重新抗炎治疗率分析:两组停药后24周、12周咳嗽症状复发患者需重新抗炎治疗率相比,差异有统计学意义(P<0.05)(4)肺功能分析:两组治疗后12周、停药后12周、24周肺功能FVC、FEV1、MEF75、PEF50、PEF25各指标相比,差异无统计学意义(P>0.05)。试验组治疗后各时点MEF75与治疗前相比,差异有统计学意义(P<0.05)。(5)生活质量分析:两组治疗后4周、8周、12周、停药后12周、24周莱塞斯特咳嗽生活质量总评分相比,差异无统计学意义(P>0.05)。组内治疗后各时点与治疗前比较,差异有统计学意义(P<0.05)。(6)影响试验观察的合并用药情况分析:两组均有合并使用影响试验观察的药物,但两组使用率差异无统计学意义(P>0.05)。(7)安全性评价:两组治疗后出现实验室指标异常变化的情况无显著差异(P>0.05),两组可疑以上不良反应的发生率无显著性差异(P>0.05)。2.通过TCMSP数据库查询共得到OB≥30%,DL≥0.18温肺疏风方人源靶点蛋白239个,哮喘相关的人源基因1413个,映射得到110个温肺疏风方作用于哮喘的靶点。通过拓扑分析得到温肺疏风方作用于哮喘的关键靶点有17个,包括JUN、STAT3、QBHIJ4、TNF、EDN1、MAPK等。通路富集分析得到温肺疏风方作用哮喘的KEGG信号通路11条,其中富集程度较高的通路包括TNF信号通路,Toll样受体信号通路、MAPK信号通路、cAMP信号通路、NOD样受体信号通路等。综合分析温肺疏风方作用于哮喘的关键靶点及通路富集结果,结合查阅文献,选取与哮喘相关性大的炎症信号通路TLR4-NF-K B/MAPK 展开研究。3.动物实验结果:(1)气道阻力:与模型组相比,温肺疏风方组小鼠气道阻力明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)炎症细胞计数分类:与模型组相比,温肺疏风方组小鼠支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞比例明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)肺组织病理:与模型组相比,温肺疏风方组小鼠肺组织炎症细胞浸润减轻,气道上皮杯状细胞增生减少。(4)ELISA炎症因子检测:与模型组相比,温肺疏风方组小鼠肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α、IL-1β炎症因子的表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(5)Real-time PCR检测:与模型组相比,温肺疏风方组小鼠肺组织TLR4、NF-κ Bp65、p38MAPK、Erk1/2、JNK mRNA表达水平明显降低,差异有统计学意义P<0.05)。(6)Western Blot检测:与模型组相比,温肺疏风方组小鼠肺组织TLR4、p-NF-κ Bp65、p-p38MAPK、p-Erk1/2、p-JNK蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.与吸入沙美特罗/替卡松粉相比,本研究未发现温肺疏风方联合吸入沙美特罗/替卡松粉在用药中及停药后24周内对CVA患者咳嗽症状及生活质量改善方面的优势。2.与吸入沙美特罗/替卡松粉相比,温肺疏风方联合吸入沙美特罗/替卡松粉有降低咳嗽症状复发率的趋势,能降低CVA复发患者的重新抗炎治疗率。3.与治疗前比较,温肺疏风方联合吸入沙美特罗/替卡松粉有助于改善CVA患者的小气道功能(MEF75)。4.温肺疏风方可能通过抑制TLR4-NF-κ B/MAPK信号通路对CVA发挥抗炎作用。