对虾中副溶血性弧菌产毒株的分离识别及抗菌肽的控制效应

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副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是典型的海洋性食物致病菌,是引起我国沿海地区细菌性食物中毒危害的首要致病菌,严重威胁人们的身体健康并造成巨大的经济损失,解决由VP引起的海产品的食源性安全问题是当务之急。为解决这一问题,首先要建立灵敏、准确的快速检测技术,尤其是产毒菌株的识别与定量检测,然后在此基础上尝试新的安全绿色的控制方法,以降低VP引发食源性疾病的风险。免疫磁珠技术是一种灵敏快速检测技术,兼具免疫学的特异性和磁场分离的高效性。本论文利用标准产毒VP菌株的抗血清分别与S型和D型磁珠偶联,选择偶联饱和吸附量大的磁珠,并以吸附量为指标优化活化剂选择、偶联时间、温度等条件,初步建立了VP免疫磁珠的制备方法,即1mg S型磁珠,用0.1mL浓度为0.005g/L的活化剂活化磁珠,添加0.2mL的血清,在25℃下摇床24h。通过灵敏度和特异性评价发现最佳偶联条件下制备出的VP免疫磁珠具有较高的特异性和灵敏度,灵敏度达到5CFU/mL。用免疫磁珠技术检测VP,缩短了实验时间且操作更简单,成本较低,为以后的研究奠定了基础。利用建立的免疫磁珠技术结合参照国标法对本地夏秋季市售的鲜虾、干虾和冷冻虾类产品中的VP进行分离鉴定和产毒识别,同时采用最大可能数法评估市售对虾中的VP污染水平,其中鲜虾和干虾的VP携带量超出了其中毒的感染剂量,必须采取有效的措施进行控制。免疫磁珠检测法与国标法相比,可以缩短整体检测时间,但在产业化综合方面有待于进一步研究完善。由于国内外市场VP溶血毒素标准品空缺,故本实验选用VP标准产毒菌株进行增菌培养,结合超声破碎、硫酸铵沉淀、DEAE纤维素柱层析等手段提取纯化出溶血活度为24.81HU/mL溶血毒素,并在此基础上建立其溶血毒素的相对溶血活度定量方法,得出在0.6-1.1HU/mL个范围内,溶血活性与溶血毒素含量的线性关系为y=0.0141x+0.4921,1个相对HU相当于36.02μg目标物质H2,用该方法可以对溶血毒素进行快速宏观定量评估。芽孢杆菌抗菌肽抗菌谱较广,对G+菌和G-菌均有较好的抑制作用,故本论文从纳豆芽孢杆菌NT-6的培养物中提取抗菌肽类物质,用牛津杯法验证其对VP的抑制作用,测定其最小抑菌浓度为1.25mg/mL。并测定其对VP生长曲线的影响、杀菌动力学以及对虾基质对纳豆菌抗菌肽杀灭VP效果的影响,结果显示抗菌肽对VP有明显的抑制作用,在VP生长期任何时间加入一定浓度的抗菌肽均可抑制菌体繁殖,但芽孢杆菌抗菌肽NT-6对处于对数生长期的VP较为敏感,对稳定期的VP作用较弱。高浓度抗菌肽对VP还具有较强的杀菌作用,杀菌效果与芽孢杆菌抗菌肽的浓度和作用时间均相关。芽孢杆菌抗菌肽NT-6可以用于对虾产品中VP的预防和控制,降低由VP引起的中毒风险。
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