【摘 要】
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自发荧光是生物体线粒体、溶酶体、叶绿体等结构在吸收特定波长激发光时所反射出的光。植物叶绿体、大型子实体类真菌及各种真菌微生物均有自发荧光现象,且其自发荧光强度随生物体种类、器官结构、组织成分、发育阶段等不同而存在差异,同时外源条件如金属离子、高温、激发光强度也会对自发荧光强度产生影响。相比于植物体,因真菌类微生物繁殖较快,外源条件可快速获取效果,目前自发荧光现象的相关研究多集中于真菌类微生物。近年
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自发荧光是生物体线粒体、溶酶体、叶绿体等结构在吸收特定波长激发光时所反射出的光。植物叶绿体、大型子实体类真菌及各种真菌微生物均有自发荧光现象,且其自发荧光强度随生物体种类、器官结构、组织成分、发育阶段等不同而存在差异,同时外源条件如金属离子、高温、激发光强度也会对自发荧光强度产生影响。相比于植物体,因真菌类微生物繁殖较快,外源条件可快速获取效果,目前自发荧光现象的相关研究多集中于真菌类微生物。近年在茯砖茶生产与消费实践中,发现湖南茯砖茶自荧光很弱或没有,而陕西茯砖茶自荧光较强的现象。由于“发花”是茯砖茶的独特生产工艺,其本质是茯砖茶生产环境中高浓度的冠突散囊菌在温湿度合适、胚砖松紧适度条件下在砖内生长繁殖并形成金花品质特征的过程,因此生产实践中“金花”的数量及质量通常用作评价茯砖茶品质优劣的重要指标之一。根据茯砖茶属于后发酵茶以及自发荧光微生物研究背景,结合散囊菌是一类包括多个亚种真菌的特点,有理由推测湖南茯砖茶和陕西茯砖茶自荧光现象存在差异的原因可能是由于两者在加工中形成的微生物种类、数量及其代谢产物不同所致,但有待进一步探究。为此,本研究以相同级别的湘益茯茶(湖南茯砖茶)和泾渭茯茶(陕西茯砖茶)为材料,采用微生物继代培养及分离纯化、形态特征观测、分子生物学测序以及自荧光条件优化等方法技术,开展两种茯砖茶自荧光微生物分离鉴定及其发光特性分析,以期在探明茯砖茶自荧光现象是否源于“发花”工艺中的微生物的基础上,探明湘益茯茶与泾渭茯茶自荧光差异产生的原因以及自荧光菌的发光特性,为茯砖茶自荧光菌的开发利用以及茯砖茶的生产与消费提供科学依据。主要研究结果及结论如下:(1)茯砖茶自荧光微生物的分离鉴定。通过固体平板法分离纯化茯砖茶中的真菌微生物,结果发现,从泾渭茯茶、湘益茯茶分别分离纯化出6类、4类自荧光真菌微生物,其中泾渭茯茶的菌落数为湘益茯茶菌落数1.4倍以上;通过进一步对自荧光菌的荧光筛选、多次继代培养及菌落形态特征观测、分子生物学测序,鉴定茯砖茶中自荧光菌主要为冠突散囊菌(Eurotium cristatum)和谢瓦氏曲霉(Aspergillus chevalieri),其中冠突散囊菌在泾渭茯茶与湘益茯茶中均有大量存在,而谢瓦氏曲霉则主要在湘益茯茶中少量存在,同时两种茶还存在多种呈丝状的发弱荧光的黑曲霉等真菌,且泾渭茯茶在种类及数量上较湘益茯茶要多;相于比湘益茯茶,泾渭茯茶自荧光菌落聚集较多,菌落堆叠密度更大。由此说明泾渭茯茶与湘益茯茶在自荧光上的差异主要是由于荧光真菌的种类、数量、菌落堆叠密度等的不同所致。(2)茯砖茶自荧光微生物的发光特性分析。研究发现,茯砖茶自荧光菌在波长为405nm、488nm的激发光下,可分别发出蓝色荧光、绿色荧光,自荧光的产生主要以冠突散囊菌为代表的散囊菌类为主,自荧光部位为闭囊壳结构;冠突散囊菌和谢瓦氏曲霉在相同培养条件下,荧光强度无显著差异,但短波激发光下的荧光强于长波激发光下的荧光;连续使用长波激光激发荧光菌,荧光强度发生衰减,但速度较慢、稳定性较好;茯砖茶自荧光菌的荧光强度受酸碱度、温度、染色浓度影响,pH3酸溶液可增强荧光强度,120℃高温及乳酸酚棉兰染色液均能较好抑制荧光强度。(3)茯砖茶自荧光微生物的“发花”茶品质分析。根据茯砖茶加工工艺及影响茯砖茶自荧光强度的因素,通过筛选弱酸溶液、水浴高温等处理,以“散茶”发花的方式将荧光菌接种至同年同级别黑毛茶,“散茶”发花后,茶叶金花茂盛。进一步通过对“发花”茶品质的分析,包括感官分析以及主要生化成分分析后发现,正常“发花”茶品质与接种的荧光菌有关,接种冠突散囊菌的效果优于接种谢瓦氏曲霉,而荧光菌强度的变化也与茶叶品质相关,其中由高温引起的荧光增强,接种谢瓦氏曲霉的茶叶品质较好,而由酸处理引起的荧光增强,接种冠突散囊菌的茶叶品质较好。综上,茯砖茶中自荧光微生物主要为冠突散囊菌和谢瓦氏曲霉,泾渭茯茶中的自荧光微生物在种类及数量比湘益茯茶要多;茯砖茶自荧光菌在波长为405nm、488nm的激发光下,分别可发出蓝色、绿色荧光,在短波激发光下的荧光明显强于长波激发光下的荧光;茯砖茶自荧光的产生主要以冠突散囊菌为主,且其部位为闭囊壳结构;茯砖茶自荧光菌的荧光强度受酸碱度、温度、染色浓度的影响,pH3酸溶液可增强荧光强度、120℃高温及乳酸酚棉兰染色液均可抑制荧光强度;利用分离纯化的茯砖茶自荧光菌以“散茶”发花的方式进行“发花”,茶叶在感官以及理化品质发生了一系列变化,这些变化与接种菌的种类、处理条件等密切相关,酸处理冠突散囊菌引起的荧光强度增强,在发花后可显著改善茶叶品质,水浴处理处理谢瓦氏曲霉引起荧光增强,发花后的茶叶品质较好。
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