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一、研究背景和目的肿瘤转移与肿瘤患者的预后直接相关[1,2]。近年来,随着生命科学研究的技术进步,肿瘤病因及其发病机制的研究已取得了重要的进展,但目前临床上对肿瘤转移的治疗并没有实质性地突破。以结直肠癌为例,当结直肠癌确诊时,已经约有20%～40%的病例发生了远处转移,而治愈性根治术后再发的肝转移率为50%左右;结直肠癌死亡的患者肝转移率高达45%～71%[1]。在近一个世纪中,外科手术治疗是结直肠癌的主要治疗手段,其5年生存率长期徘徊在50%左右[3]。因而,加强结直肠癌发生发展机制的基础研究,阐明结直肠癌转移的分子机制,对结直肠癌转移进行预测、诊断和预后判断等是结直肠癌研究的前沿课题,对于提高结直肠癌治愈率,减少死亡率具有重要的科学意义。人DOC-2/DAB2相互作用蛋白基因(DAB2IP),又称为ASK1相互作用蛋白(AIP1)是本课题组前期筛选出的一个结直肠癌转移相关候选基因[4,5]。DAB2IP是最近发现的RasGAP家族的一个新成员,它直接与DAB2(也被称为DOC-2)的N端区域相互作用,形成一个独特的蛋白复合体,并对Ras介导的信号通路起负向调控作用。目前有关DAB2IP与肿瘤的研究约有26篇文献,其中有关分子机制的研究有16篇,主要集中在对前列腺癌、肝癌的研究中[8-12]。研究发现DAB2IP在前列腺癌中表达下调,DAB2IP是组蛋白甲基转移酶Ezh2的靶基因,Ezh2能直接抑制DAB2IP在前列腺中的表达;此外,启动子的甲基化也是其表达下调的主要原因[13-15]。随后的研究显示DAB2IP在其它肿瘤如乳腺癌、肝癌、肺癌、移行细胞癌中的表达均下调,且与其启动子甲基化有关[15-17]。此外,DAB2IP还与肿瘤的侵袭和转移密切相关[9,12]。最近有学者根据单核苷酸多态性的研究,提出DAB2IP的遗传学变异能预测侵袭性前列腺癌的危险[18]。本课题组前期实验发现DAB2IP在结直肠癌组织及高转移能力的结直肠癌细胞株中低表达;通过体内、外实验证实了干扰DAB2IP促进结直肠癌细胞的生长、侵袭和转移能力。但目前有关DAB2IP参与结直肠癌的生长、侵袭和转移的分子机制尚无报道。本课题选取DAB2IP作为研究靶点,进一步探讨DAB2IP在结直肠癌侵袭和转移中的相关机制,主要内容如下:(1)DAB2IP调控分子的筛选及验证。(2)DAB2IP分子作用机制的设想及验证。(3)DAB2IP、hnRNPK、活性MMP2在结直肠癌组织中的表达相关性研究。本课题旨在为肿瘤侵袭、转移的临床诊治、预后及药物研发提供新的思路和靶点。二、研究方法1、DAB2IP调控分子的筛选及验证(1)DAB21P的CDS区3399bp,上下游GC含量差异较大,多次构建DAB2IP过表达载体均失败。因此只能采用慢病毒感染的方法构建SW480、HCT116(本课题组前期研究中筛选出来高表达DAB2IP的结直肠癌细胞株)DAB2IP 干扰稳定株(SW480/siDAB2IP、HCT116/siDAB2IP)和对照细胞株(SW480/NC、HCT116/NC),并使用 Real-Time PCR 和 Western blot 鉴定其干扰效率。(2)利用转移相关基因芯片筛选DAB2IP干扰后下游差异表达基因,并用Real-Time PCR 进行验证。(3)利用2-DDIGE技术筛选DAB2IP干扰后下游差异表达蛋白,并用Real-Time PCR及Western blot进行验证。2、DAB2IP分子作用机制的设想及验证(1)采用慢病毒感染的方法用干扰hnRNPK的慢病毒上清转染分别转染SW480/siDAB2IP、HCT116/siDAB2IP细胞株,构建双干扰稳定株(SW480/siDAB2IP/sihnRNPK、HCT116/siDAB2IP/sihnRNPK);构建hnRNPK过表达稳定株(SW480/hnRNPK、HCT116/hnRNPK)和对照细胞株(S W480/MOCK、HCT116/MOCK)。利用Real-Time PCR以及Western blot分别验证hnRNPK的表达变化。(2)利用 Real-Time PCR 检测 SW480 及 HCT116 不同处理组(NC、siDAB2IP、siDAB2IP/sihnRNPK、siDAB2IP+U0126(MAPK 激酶抑制剂)、MOCK、hnRNPK)中 DAB2IP、hnRNPK、MMP2 基因 mRNA 的表达水平;利用 Western blot 检测上述细胞株中 DAB2IP、p-ERK、ERK、p-hnRNPK、hnRNPK、活性MMP2蛋白的表达水平。(3)利用核浆分离Western blot实验检测SW480及HCT116不同处理组(NC、siDAB2IP、siDAB2IP+U0126)中细胞核及细胞浆内p-hnRNPK蛋白的表达水平。(4)利用激光共聚焦显微镜检测SW480及HCT116不同处理组(NC、siDAB2IP、siDAB2IP/sihnRNPK、siDAB2IP+U0126、MOCK、hnRNPK)中p-hnRNPK的表达水平及亚细胞定位的情况。(5)利用双荧光素酶报告实验检测SW480及HCT116不同处理组(NC、siDAB2IP、siDAB2IP/sihnRNPK、MOCK、hnRNPK)中 hnRNPK 蛋白对 MMP2转录活性的影响。(6)采用MTT、侵袭实验检测SW480及HCT116不同处理组(NC、siDAB2IP、siDAB2IP/sihnRNPK、siDAB2IP+U0126、MOCK、hnRNPK)中增殖及侵袭的情况。(7)采用裸鼠皮下成瘤实验、肿瘤细胞尾静脉注射实验观察SW480不同处理组(NC、siDAB2IP、siDAB2IP/sihnRNPK、MOCK、hnRNPK)中体内皮下成瘤及瘤细胞肺转移的情况。3、DAB2IP、hnRNPK、活性MMP2在结直肠癌组织中的表达相关性研究(1)利用Real-Time PCR和Western blot检测20对结直肠癌及癌旁新鲜配对组织中DAB2IP、hnRNPK、MMP2的表达情况。(2)利用免疫组织化学检测50对结直肠癌及癌旁正常配对组织中DAB2IP、hnRNPK、活性MMP2的表达情况。三、研究结果1、DAB2IP调控分子的筛选及验证1.1构建DAB2IP干扰稳定株Real-Time PCR 及 Western blot 检测显示成功构建了 SW480、HCT116 细胞DAB2IP 干扰稳定株(Real-Time PCR:SW480 T=144.157,P<0.001;HCT116 T= 169.639,P<0.001)。1.2筛选DAB2IP干扰后下游差异表达分子转移相关芯片结果显示:共筛选出差异表达基因89个,表达上调的58个,表达下调的31个,其中MMP2差异最大,上调6.92倍,故初步确定MMP2为下一步研究靶点;2-DDIGE结果显示:共筛选出下游差异蛋白30个,表达上调的有18个,表达下调的有12个,依据差异倍数≥2倍及文献查阅初步确定hnRNPK蛋白为另一个研究靶点。1.3验证DAB2IP干扰后下游差异表达分子(1)Real-TimePCR 检测显示:SW480/siDAB2IP 及 HCT116/siDAB2IP 细胞株中MMP2的表达显著高于各自的NC组(T=-62.973,P<0.001;T=-37.862,P<0.001),与基因芯片结果一致。(2)Real-Time PCR 及 Western blot 检测显示:SW480/siDAB2IP 及HCT116/siDAB2IP细胞株中hnRNPK的表达显著高于各自的NC组(Real-Time PCR:SW480T=-17.985,P<0.001;HCT116T=-11.191,P<0.001),与2-DDIGE结果一致。2、DAB2IP分子作用机制的设想及验证2.1构建hnRNPK过表达稳定株Real-Time PCR 及 Western blot 检测显示成功构建了 SW480、HCT116 细胞hnRNPK 过表达稳定株(Real-Time PCR:SW480T=-15.585,P<0.001;HCT116 T=-27.594,P<0.001)。2.2构建DAB2IP/hnRNPK双干扰稳定株Real-Time PCR 及 Western blot 检测显示成功构建了 SW480、HCT116 细胞DAB2IP/hnRNPK 双干扰稳定株(Real-Time PCR:SW480T=50.922,P<0.001;HCT116T=70.139,P<0.001)。2.3 DAB2IP分子作用机制的设想及验证查阅文献得知DAB2IP可以活化Ras/MAPK通路,MAPK/ERK活性增强促进hnRNPK磷酸化并促进其向核内转移,而hnRNPK能够在核内调控MMP12(MMP家族的另一个成员)的转录从而促进肿瘤的迁移和侵袭。因此我们设想DAB2IP干扰激活Ras/MAPK通路,p-ERK使p-hnRNPK表达量增加并促进其入核,从而增强MMP2的转录活性。我们对上述设想进行了验证:(1)对SW480、HCT116两种细胞各种处理的Real-Time PCR检测结果显示:siDAB21P/sihnRNPK、siDAB2IP+ U0126 相较于 siDAB2IP,hnRNPK 表达明显减少(F= 165.215,P<0.001;F= 158.791,P<0.001),MMP2 的表达也明显减少(F= 199.817,P<0.001;F= 209.797,P<0.001);过表达 hnRNPK组相较于MOCK 组,MMP2 表达量明显减少(T=-28.619,P<0.001;T=-10.702,P<0.001)。(2)对SW480、HCT116两种细胞各种处理的Western blot检测结果显示:siDAB2IP/sihnRNPK 相较于 siDAB2IP,p-hnRNPK、hnRNPK、活性 MMP2 蛋白表达明显减少,ERK及p-ERK蛋白变化不显著;过表达hnRNPK相较于MOCK,p-hnRNPK、hnRNPK、活性MMP2蛋白表达明显增加,p-ERK与ERK蛋白变化不显著;siDAB2IP 相较于 NC,p-hnRNPK、hnRNPK、活性 MMP2 与 p-ERK蛋白表达均增加,MAPK蛋白变化不显著;siDAB2IP+U0126相较于siDAB2IP,p-hnRNPK、hnRNPK、活性MMP2与p-ERK蛋白表达均减少,ERK蛋白变化不显著。以上结果证实了存在DAB2IP/hnRNPK/MMP2信号轴,即DAB2IP干扰通过激活Ras/MAPK通路增加hnRNPK的磷酸化水平,从而使活性MMP2的表达量增加。2.4 DAB2IP干扰促进p-hnRNPK入核细胞核浆分离后Western blot检测了 SW480、HCT116细胞不同处理组中p-hnRNPK蛋白在细胞核及细胞浆内的表达变化,结果显示:与NC组相比,siDAB2IP 组 p-hnRNPK 蛋白表达明显增加,siDAB2IP+U0126 相交于 siDAB2IP又明显减少;细胞浆内p-hnRNPK蛋白表达水平变化不明显。我们又用激光共聚焦显微镜检测了 SW480细胞不同处理组中p-hnRNPK的表达水平和亚细胞定位情况。结果显示:siDAB2IP与NC、siDAB2IP/sihnRNPK、siDAB2IP+U0126 相比,核内 p-hnRNPK 表达增加,siDAB2IP/sihnRNPK 与siDAB2IP+U0126表达相近;过表达hnRNPK与MOCK相比,核内p-hnRNPK表达增加。上述结果表明DAB2IP干扰通过激活Ras/MAPK通路促进p-hnRNPK入核。2.5 hnRNPK增强MMP2的转录活性接下来我们用双荧光素酶实验在SW480、HCT116细胞不同处理组中检测了hnRNPK对MMP2转录活性的影响,结果显示:过表达hnRNPK与MOCK相比荧光素酶活性均显著增强(T=-11.055,P<0.001,T=-15.544,P<0.001),si DAB2IP与NC、siDAB2IP/sihnRNPK相比荧光素酶活性显著增强(F=101.166,P<0.001,F=196.388,P<0.001)。2.6 DAB2IP通过调控hnRNPK影响结直肠癌细胞体外生物学行为(1)MTT比色法检测SW480、HCT116细胞不同处理组的体外增殖能力,结果显示:与MOCK组相比,过表达hnRNPK组的细胞增殖速度明显升高;与NC组相比,siDAB2IP组的细胞增殖速度明显升高;与siDAB2IP组相比,siDAB2IP +U0126组、siDAB2IP/sihnRNPK组的细胞增殖速度明显降低,(F=50.619,P<0.001;F= 55.146,P<0.001;F= 856.489,P<0.001;F= 91.361,P<0.001)。(2)Boyden侵袭小室观察SW480、HCT116细胞不同处理组的体外侵袭能力,结果显示:与MOCK组相比,过表达hnRNPK组的细胞侵袭能力明显升高(T=-8.457,P<0.001;T=-17.714,P<0.001);与 NC 组及 siDAB2IP/sihnRNPK组相比,siDAB2IP组的细胞侵袭能力明显升高(F=219.632,P<0.001;F= 241.890,P<0.00I);与siDAB2IP组相比,NC组及siDAB2IP +U0126组的细胞侵袭能力明显降低(F=542.798,P<0.001;F= 172.864,P<0.001)。以上结果显示:DAB2IP干扰通过调控hnRNPK促进结直肠癌细胞株的体外增殖及侵袭,而再干扰hnRNPK及加入U0126后能逆转这个过程。2.7 DAB2IP通过调控hnRNPK影响结直肠癌细胞体内生物学行为SW480/MOCK、SW480/hnRNPK 与 SW480/NC、SW480/si DAB2IP、SW480/si DAB2IP/sihnRNPK 5种不同处理的细胞株进行裸鼠皮下成瘤和尾静脉注射体内转移实验。裸鼠皮下成瘤结果显示:MOCK组的皮下肿瘤生长速度明显慢于hnRNPK过表达组(F=27.485,P<0.001),NC组与siDAB2IP组皮下肿瘤生长速度大致相同但均明显慢于siDAB2IP组(F=6.917,P=0.011),此外SW480/hnRNPK和SW480/siDAB2IP组皮下瘤HE切片肿瘤边缘更容易观察到肿瘤细胞坏死、边缘不规则及周围基质溶解现象。裸鼠的尾静脉体内转移实验结果显示:与SW480/MOCK组相比SW480/hnRNPK组中裸鼠出现肺脏转移的结节数目增多(T=-2.386,P=0.38),SW480/NC 及 SW480/si DAB2IP/si hnRNPK组裸鼠肺脏转移的结节数目大致相同但均明显少于SW480/si DAB2IP组(F=3.916,P=0.043)。以上结果显示:DAB2IP干扰通过调控hnRNPK促进结直肠癌细胞株的体内皮下成瘤及尾静脉肺转移,而再干扰hnRNPK能逆转这个过程。3、DAB2IP、hnRNPK、活性MMP2在结直肠癌组织中的表达相关性研究(1)利用荧光定量PCR检测DAB2IP、hnRNPK、活性MMP2在20例新鲜结直肠癌与正常配对组织中的表达,相关性分析结果显示DAB2IP与hnRNPK、MMP2 均呈负相关(Pearson Correlation=-.445,P=0.049;Pearson Correlation=-.554,P=0.011)。(2)利用Western blot检测DAB2IP、hnRNPK、活性MMP2在上述20例新鲜结直肠癌组织与正常配对组织中的表达,结果显示:DAB2IP在正常组织中的表达显著高于癌,而hnRNPK及活性MMP2在癌中的表达显著高于正常组织。(3)利用免疫组化检测了 50对结直肠癌与正常的配对组织,结果显示:DAB2IP在正常组织中的表达显著高于癌;hnRNPK在正常组织中以胞浆阳性为主,在癌中以核浆强阳性为显著的特点;活性MMP2在癌组织中的表达显著高于正常组织。四、结论1、揭示DAB2IP在肿瘤转移中的一个新作用机制;2、阐明DAB2IP/hnRNPK/MMP2轴在结直肠癌侵袭、转移过程中的作用。