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研究目的:高尿酸血症是一种指尿酸合成增加和(或)尿酸排泄减少所引起的代谢性疾病。痛风性肾病是一种由高尿酸血症导致肾脏内尿酸盐微结晶沉积,引起间质炎症反应,肾小管阻塞及肾单位丧失的疾病,以肾间质和肾小管内出现尿酸盐沉积,肾小管上皮细胞肿胀甚至坏死为主要病理特征。高尿酸血症是痛风性肾病的重要理化基础,以尿酸转运蛋白调控异常为主要发病机制。因此,我们考虑以尿酸转运蛋白基因,肾间质纤维化蛋白,肾损伤蛋白的调控为药物的靶点研究肾茶对高尿酸血症及痛风性肾病肾脏的保护作用及机制。肾茶性甘、淡,味苦、凉,具清热除湿,排石利水之功效,在我国西双版纳和印度尼西亚等东南亚国家中常用于肾脏系统疾病,高尿酸血症,痛风的防治,疗效明显。因此,本研究通过建立高尿酸血症和痛风性肾病两种动物模型,探讨肾茶对高尿酸血症和痛风性肾病肾脏的保护作用及分子机制;通过体外建立尿酸诱导人肾近曲小管上皮细胞(Human kidney-2 cells,HK-2),构建肾间质纤维化细胞模型,探讨肾茶对尿酸致HK-2细胞损伤的保护作用。研究方法:1.采集15批不同产地的肾茶,应用HPLC法建立肾茶的指纹图谱,并对肾茶的迷迭香酸和咖啡酸进行含量测定。并选取15批中质量最佳的产地的肾茶以Box-Behnken效应面法优化提取纯化工艺,以得到成分稳定的实验用肾茶提取物。2.选用KM种小鼠作为高尿酸血症动物模型进行实验研究,观察肾茶提取物对高尿酸血症小鼠血清尿酸,尿素氮,肌酐水平的影响,用HE染色观察肾茶对小鼠肾脏病理形态学上的影响,用免疫组织化检测肾茶对小鼠肾脏尿酸转运蛋白有机阴离子家族成员OAT1的表达,中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL),TIMP-1的表达。采用实时荧光定量PCR法检测小鼠肾脏皮质URAT1和OAT1基因的表达。采用蛋白印迹法(Western Blot)探讨肾茶对小鼠肾皮质TIMP-1、URAT1、OAT1蛋白表达的影响。3.选用酵母联合腺嘌呤的方法建立SD大鼠痛风性肾病模型,用代谢笼收集24小时尿液,测定尿蛋白含量,观察肾茶提取物对痛风性肾病大鼠血清尿酸,尿素氮,肌酐水平,肾脏皮质NAG水平的影响,用HE染色观察肾茶对大鼠肾脏病理形态学上的影响,采用实时荧光定量PCR法检测大鼠肾脏皮质URAT1和OAT1基因的表达。4.采用蛋白芯片双抗体夹心法技术,对痛风性肾病大鼠中肾损伤因子进行筛选,并经免疫组织化学和蛋白印迹法(Western Blot)进行验证。采用Western Blot探讨肾茶对大鼠肾皮质尿酸转运蛋白URAT1、OAT1蛋白表达的影响。5.采用尿酸刺激人肾近曲小管上皮细胞(HK-2)造成细胞损伤,建立肾间质纤维化细胞模型,以肾茶提取物及其主要单体干预,通过(Cell Counting Kit-8,CCK8)法检测肾茶HK-2对细胞的活力的影响和流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测肾茶提取物对HK-2细胞的凋亡和周期。6.体外建立黄嘌呤氧化酶活性(xanthineoxidas,XOD)筛选体系,采用HPLC法测定酶促反应体系中底物黄嘌呤在反应前后含量的变化,并用HPLC法检测高尿酸血症小鼠肝脏黄嘌呤的含量,以此考察肾茶对黄嘌呤氧化酶的抑制作用。采用D-半乳糖复制大鼠亚急性衰老模型,通过行为学实验和超氧化物歧化酶活性的检测来评价肾茶对衰老大鼠的抗氧化作用。研究结果:1.发现了采集的15批样品中云南西双版纳产的肾茶中迷迭香酸和咖啡酸含量最高,优选了肾茶的最佳提取纯化工艺。2.生化指标结果显示:肾茶醇提物能有效降低高尿酸血症小鼠血清血清尿酸,尿素氮,肌酐水平,HE染色病理观察结果显示:肾茶能保护小鼠肾脏;免疫组织化学结果显示:肾茶能调节小鼠肾脏尿酸转运蛋白有机阴离子家族成员(organic anion transporter 1,OAT 1)的表达,下调肾损伤蛋白(neutrophilgelatinase-associated lipoealin,NGAL),(matrix metalloproteinase-1,TIMP-1)的表达;实时荧光定量 PCR 结果显示:肾茶能上调高尿酸血症小鼠OAT1 mRNA的表达。Western Blot结果显示:肾茶醇提物能降低高尿酸血症小鼠肾组织TIMP-1、(renal urate transporter 1,URAT1)蛋白的表达的表达。肾茶醇提物中和肾茶总黄酮中、高剂量均能上调高尿酸血症小鼠肾脏OAT1蛋白的表达。3.生化指标结果显示:肾茶醇提物能有效降低痛风性肾病大鼠血清尿酸,尿素氮,肌酐水平,肾皮质β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(n-acetyl-β-D-glucosaminidase,NGA)含量,改善大鼠肾功能;HE染色病理切片观察结果显示:肾茶能保护大鼠肾脏;实时荧光定量PCR结果显示:肾茶高剂量组能上调高尿酸血症小鼠OAT1 mRNA的表达。4.蛋白芯片双抗体夹心法结果显示:筛选出3种肾损伤蛋白的表达有差异,发现肾茶醇提物高剂量能显著降低痛风性肾病大鼠肾组织NGAL、TIMP-1、KIM-1蛋白的表达。免疫组化的和Western Blot的验证结果显示呈一致性。5.体外细胞试验结果显示:肾茶提取物及迷迭香酸对尿酸诱导的HK-2细胞损伤具有一定的保护作用。6.黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidas,XOD)活性和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)结果显示:肾茶无论是体外还是体内对XOD的都具有一定的抑制作用,肾茶在体内能升高SOD活力,降低(malondialdehyde,MDA)含量,提高抗氧化能力。总结:肾茶提取物能减轻高尿酸血症小鼠的肾损伤和痛风性肾病大鼠肾损伤。