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乙醇脱氢酶是许多有机体中主要短链醇代谢的关键酶。典型的乙醇脱氢酶是一个锌结合酶,以二聚体形式作用且依赖NAD(P)+辅助因子互变乙醇和乙醛。植物ADH的3个保守功能域分别为锌结合位点、Rossmann折叠NAD(P)+结合蛋白和具有GroES结构的ADH_N结构域。这3个保守结构在物种中具有相当高的保守性。为了探究拟南芥乙醇脱氢酶的结构与生化特性,本实验构建了拟南芥ADH蛋白的原核表达载体,纯化可溶性ADH蛋白并进行体外功能结构试验。主要结果如下:1.成功构建得到的原核表达拟南芥ADH蛋白载体,以pET-HTT为表达载体,Rosetta为宿主表达细菌,20℃条件下0.1%IPTG诱导15 h,纯化得到了高纯度的拟南芥ADH蛋白。2.利用全波长酶标仪测量反应产物NADH在340 nm的吸光度值的变化和生化反应动力学理论,得到了拟南芥ADH酶学性质,包括最适反应PH为10.5,具有广泛的底物选择性,最适反应底物为乙醇。最大反应速率Vmax(NAD)为7.9±2.6 U/mg,Km(NAD)值为1.65±0.42 mM。3.根据序列对比和分子动力学分析的结果,我们发现乙醇脱氢酶两个结构域是由连接肽连接的,连接肽中的甘氨酸残基有可能对两个结构域的相对移动以及酶活力有重要作用,为验证猜想,我们构建了三个突变体载体并分别纯化其蛋白,通过比较野生型和突变体蛋白的酶活力,我们发现酶活力并没有发生显著变化。