肠粘膜屏障包括机械屏障、生物屏障和免疫屏障,三者其共同构成一道严密的保护层,在阻止肠腔内细菌、毒素进入机体并维持机体内环境稳定上起重要作用。在感染等重症疾病时,机体免疫功能发生变化,释放的炎症介质可导致肠粘膜损伤,肠粘膜屏障功能破坏,致肠腔内细菌和毒素大量入血,肠道细菌易位,引起远隔器官感染,同时内毒素血症导致肠组织损伤时,肠组织可释放大量的细胞因子、炎症介质入血,导致全身炎症反应综合征（System Inflammation ReactionSyndrome,SIRS）的发生,加速危重症的过程。因此,目前认为肠道功能障碍是导致多器官衰竭（Multiple Organ Failure,MOF）的重要因素之一。感染、败血症是儿科常见病之一,其危重症常伴发胃肠功能障碍,出现腹胀、肠鸣音减弱或消失等症状体征。此时,常提示病情加重和预后不良,晚期病死率极高。肠粘膜受损致屏障功能障碍是肠功能衰竭发生的病理机制之一。肠粘膜损伤的发病机制并不完全清楚。危重病伴发胃肠功能障碍,常提示预后不良,及早发现和预防对危重患儿的病情逆转有重要意义。因此,对其机制研究并探讨有效的保护措施成为研究的重点。内毒素血症可通过缺氧、炎症介质释放、自由基增多使肠粘膜屏障受损,致使大量细菌易位,引起远隔器官感染,最终造成多器官功能衰竭,甚至死亡。内毒素可促使炎症介质释放,如TNF-α,IL-1,IL-6等,炎症介质释放增多,导致SIRS,抗炎介质,如IL-4,IL-10等,也随之释放,起到内源性抗炎作用,保持机体内环境稳定。但抗炎介质释放过量,既可产生免疫功能抑制及对感染的易感性,而引起代偿性抗炎介质反应综合征（Compensary Anti-inflammentary,ResponseSyndrome,CARS）。当SIRS与CARS并存时,彼此间相互作用加强,可形成对机体损伤更强的免疫失衡,引起混合性抗炎反应综合征（Mixed AntagonistsResponse Syndrome,MARS）,因此,SIRS、CARS和MARS均是引起MOF的发病基础。TLR是近年在哺乳动物和人体中发现的与果蝇同源的Toll蛋白,命名为TLR（Toll-like receptol,TLR）。TLR能够识别外源性微生物,在病原体入侵机体时启动先天性免疫反应,清除侵入的病原微生物。TLR属于Ⅰ型跨膜蛋白,其胞外区结构由富含亮氨酸的重复序列（LRR,Leucine-rich repeat）组成.不同的TLR之问的胞外区同源性较差,提示各个TLR分子的配体各有不同的结构。TLR胞内区结构与白介素-1受体（Interleukin-1 Receptor,IL-1R）高度同源,称为TIL区（TLR/IL-1R homologous region）。LRR是蛋白质和蛋白质相互作用的结构基序,可以直接识别和结合病原体或其产物、激发机体的非特异性免疫反应。与IL-1R同源的胞内区与核转录因子-кB（NF-кB）的激活有关。TLR过识别病原微生物及其细胞壁均具有的类脂特殊结构来介导宿主先天性免疫反应和获得性免疫反应的产生。在病原体存在的一类具有保守序列的特殊结构被称为病原相关分子模式（PAMP,Pathogen associated molecular patterns）,包括G菌的脂多糖（LPS）中的类脂A,G+菌的的肽聚糖（PGN）、脂磷壁酸（LTA）、脂阿拉伯甘露糖（LAM）,分枝杆菌和疏密螺旋体的脂蛋白与脂肽,酵母菌和支原体的某些成分以及细菌DNA中非甲基化CpG基序等。迄今已发现TLR家族中的11种TLR。各个TLR均有其特殊作用,通过识别不同的PAMP并与之相互作用而激活,通过信号转导激活免疫细胞,释放细胞因子,启动先天性免疫反应。谷氨酰胺（Glutamine,Gln）是机体含量最丰富的条件氨基酸,是许多快速分裂细胞,如肠上皮细胞,淋巴细胞等的能源物质,也是合成核苷酸的前质,可促进蛋白质的合成和抑制蛋白质的降解,因此,Gln是维持肠道粘膜代谢、结构和功能的必需营养物质,对维护肠粘膜的细胞生长、分化和增殖以及维持肠道粘膜上皮的完整性具有重要意义。但以往对Gln在肠粘膜功能上的作用,主要集中在营养方面,而对Gln减少炎症介质释放的作用机制并未阐明。肠三叶因子（Intestinal trefoil factor,ITF）是三叶肽家族成员之一,由肠粘膜上皮杯状细胞分泌,广泛存在于胃肠道,具有特征性的三叶结构。由于其特殊结构,不仅具有一般生长因子促细胞增殖的作用,且具有结构稳定,不被多种消化酶破坏的生物学特性。肠三叶因子对肠粘膜具有保护作用。研究证实给予rTIF后肠粘膜损伤明显减轻,对ITFs在内毒素致肠损伤的保护作用机制并不十分清楚。为此,本研究以LPS诱导内毒素血症,致幼鼠肠损伤为对象,探讨TLR在肠损伤的作用机制及谷氨酰胺和肠三叶因子在肠损伤的保护机制:1、在正常肠组织中,TLR2、4mRNA与蛋白的表达;2、在内毒素血症时,TLR2、4mRNA和蛋白表达的变化及与肠损伤的关系;3、谷氨酰胺对TLR2、4mRNA和蛋白表达的影响,及对肠粘膜损伤的保护作用;4、肠三叶因子对TLR2、4mRNA和蛋白表达的影响,及对肠粘膜损伤的保护作用。实验材料与方法一、动物模型及分组Wistar健康10日龄幼鼠,雌雄不限,体重15-25g,由中国医科大学附属二院医学动物实验中心提供。以LPS 5mg/kg腹腔注射的方法制备Wistar幼鼠内毒素血症的模型。72只幼鼠以腹腔注射药物的不同,分为NS组（生理盐水对照组,生理盐水1ml/kg,8只）、LPS组(内毒素组,EcoliO₅₅:B₅ 5mg/kg,5mg/ml,48只)、Gln组（谷氨酰胺组,LPS 5mg/kg+Gln 10ml/kg,含谷氨酰胺活性成分13.46g/100ml,8只）和ITF组（肠三叶因子组,LPS 5mg/kg+rITF 0.1ml/只,8只）。二、标本采集和处理NS组、Gln组、ITF组均于腹腔注射后3h,LPS组分别于腹腔注射后3、6、12、24、48、72h给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉,处死,按以下方法处理和保存:1、留取近回盲部肠组织约0.5～1cm分别放于4%甲醛溶液和2.5%戊二醛溶液中固定,分别做HE染色、免疫组化和透射电镜观察。2、其余肠组织于无菌条件下取材,立即置于液氮中速冻,并转-70℃保存待测。三、实验方法1、动念观察幼鼠的一般状态和死亡情况。2、病理形态学研究（1）动物麻醉后,剖开幼鼠腹腔肉眼观察肠组织形态学改变。（2）光镜观察:肠组织固定后,常规HE染色,镜下观察肠组织病理变化。（3）电镜观察:肠组织固定后,常规做透射电镜,观察肠组织超微结构和肠绒毛的变化。①ELISA法检测肠组织TNF-α,IL-4,IL-10分泌水平。②免疫组化法检测肠组织TLR2、4和NF-кB蛋白表达。③RT-PCR法检测肠组织TLR2、4和NF-кB mRNA表达。④Western Blotting法检测肠组织TLR2、4和NF-кB蛋白表达。四、统计学分析所有数据均以均值±标准差（（?）±S）表示,差异比较用SPSSl3.0统计软包进行方差分析（ANOVA）,组间比较用LSD法检验及制作统计图。P<0.05提示有显著性差异。结果一、幼鼠的一般状况对照组动物腹腔注射NS后进食、活动正常,一般状况无明显变化,无死亡。LPS组动物在腹腔注射LPS后出现腹泻、腹胀明显等胃肠功能障碍症状,进食少,活动差,成活鼠观察其体重不增或明显下降,死亡率约8.3%。而Gln组和ITF组上述临床症状较内毒素组轻,无死亡。二、幼鼠肠组织病理学变化1、大体观察;LPS组动物在腹腔注射LPS后3h可见肠管、肠系膜轻度充血肿胀,6h时可见充血肿胀明显,有胃潴留,部分肠管扩张,肠腔内有出血;12h上述症状明显,24h仍有胃潴留及肠管充血,72h上述症状有好转。Gln组和ITF组以上症状较内毒素组轻,NS组无明显变化。2、光镜变化;NS组肠绒毛完整,肠上皮细胞排列整齐,杯状细胞少见,无明显异常改变。LPS组给予LPS后3h肠组织可见明显异常,绒毛间质可见有充血,少许炎性细胞浸润,水肿明显,肠上皮细胞排列紊乱,细胞水肿;6h见间质水肿吸收,充血不明显,杯状细胞增加,上皮细胞仍水肿,细胞内出现玻璃样物质,呈透明样变;12h上述变化更加明显,细胞水肿加重,玻璃样物质明显增加,杯状细胞增加;24h可见绒毛间质、上皮细胞水肿明显减轻,杯状细胞仍较多;48h上述改变明显恢复,间质充血明显,上皮细胞密度增加,有增生改变;72h恢复明显,上皮细胞增生明显增多。杯状细胞较多。Gln组和ITF组有绒毛间质轻度充血,无明显水肿,细胞轻度水肿,较LPS组明显减轻,杯状细胞明显增加。3、电镜变化:NS组上皮细胞柱状,核呈卵圆形.顶部微绒毛排列整齐,细胞间紧密连接完整.内质网及线粒体清晰:内毒素作用下顶部微绒毛疏松,轻度水肿,微绒毛排列不整、部分断裂、缺失.部分紧密连接增宽或断裂,细胞核固缩,形成凋亡小体,染色质边聚。LPS作用后3h既有改变,至24h细胞损伤达到高峰,72h有所恢复。三、幼鼠肠组织TNF-α、IL-4、IL-10的变化腹腔注射LPS后3h肠组织TNF-α、IL-4、IL-10分泌明显增加,较NS组有显著差异（P<0.05）,TNF-α增加更为明显;TNF-α、IL-4、IL-10分泌均于6h达到高峰,于12h有所下降,24h肠组织TNF-α稍高于NS组（P>0.05）,IL-4、IL-10又明显增加（P<O.01）,至72h下降,且较NS组有显著下降（P<0.01）:G1n组和ITF组肠组织TNF-α、IL-4、IL-10明显低于LPS组,差异非常显著（P<0.01）。四、幼鼠肠组织TLR2、4和NF-кB mRNA表达的变化在NS组TLR2 mRNA表达较弱,TLR4 mRNA表达较明显,NF-кB mRNA稍有表达。TLR2 mRNA在LPS组各时间点表达明显高于NS组,且差异非常显著（P<0.01）:TLR2 mRNA表达逐渐增高,于72h达高峰。TLR4 mRNA表达在LPS腹腔注射3h即达到高峰,显著高于NS组（P<0.01）,然后下降,于12小时下降明显:于24h、48h又复增高,明显高于NS组,差异非常显著（P<O.01）;于72h明显下降,且低于NS组,差异显著（P<0.01）。NF-кB mRNA表达在LPS腹腔注射3h即达到高峰,显著高于NS组（P<0.01）,然后下降,于6小时下降至最低点,明显低于NS组,差异显著（P<O.05）;于24h、48h又复增高,明显高于NS组,差异非常显著（P<0.01）;于72h明显下降,且低于NS组,但无明显差异（P>0.05）。五、Gln对幼鼠肠组织TLR2、4和NF-кB mRNA及蛋白表达的影响1、NS组TLR2表达较弱,LPS组TLR2表达明显增强,谷氨酰胺组TLR2表达明显弱于LPS组,差异显著（P<0.05）。TLR4在NS组有一定的表达,LPS组表达显著上调,差异非常显著（P<0.01）,谷氨酰胺组表达明显下调,差异非常显著（P<0.01）。NF-KB在NS组表达非常弱,LPS组表达明显增高,差异显著（P<0.05）,谷氨酰胺组明显下调,差异非常显著（P<0.01）。2、经Western Blot分析在NS组TLR2蛋白表达非常弱.在LPS组表达明显增强,Oln组表达明显弱于LPS组,差异均非常显著（P<0.01）。TLR4蛋白经WesternBlot分析见NS组有一定的表达,LPS组表达明显增强,Gln组表达明显弱于LPS组,差异均非常显著（P<0.01）。NF-кB在NS组表达较弱,在LPS组明显增强,Gln组表达明显弱于LPS组,差异非常显著（P<0.01）六、Gln对幼鼠肠组织TNF-α、IL-4、IL-10的影响LPS组TNF-α,IL-4,IL-10较NS组明显增高,差异显著（P<0.05或P<0.01）;Gln组TNF-α,IL-4,IL-10较LPS组明显降低,差异非常显著（P<0.01）。Gln组IL-4,IL-10也明显低于NS组,差异非常显著（P<0.01）。七、ITF对幼鼠肠组织TLR2、4和NF-кB mRNA及蛋白表达的影晌1、TLR2 mRNA表达LPS组较NS组明显增高,差异非常显著（P<0.01）,ITF组较NS组、LPS组均明显增高,且差异非常显著（P<0.01）。肠组织TLR4、NF-кBmRNA表达在LPS组均也较NS组明显增高,差异非常显著（P<0.01）,ITF组TLR4、NF-кB mRNA表达均较LPS组明显降低,差异非常显著（P<0.01）,且均低于NS组,TLR4降低更为明显,差异显著（P<0.01）。2、免疫组化见TLR2蛋白表达在NS组肠绒毛上皮细胞胞膜可见颜色较浅的棕黄色染色,LPS组蛋白表达明显增强,较NS组有非常显著的差异（P<0.01）,ITF组蛋白表达较NS组、LPS组均明显增强,差异非常显著（P<0.01）。TLR4蛋白表达在NS组肠绒毛上皮细胞胞膜可见棕黄色染色较浅,LPS组蛋白表达明显增强,较NS组有显著的差异（P<0.01）,ITF组蛋白表达明显减弱,差异非常显著（P<0.01）。NF-кB蛋白表达在NS组肠绒毛上皮细胞胞浆和胞核内可见少量棕黄色染色,LPS组蛋白表达明显增强,较NS组有显著的差异（P<0.01）,ITF组蛋白表达较LPS组明显降低,差异非常显著（P<0.01）。八、ITF对幼鼠肠组织TNF-α,IL-4,IL-10的影响LPS组肠组织TNF-α较NS组明显增高,差异非常显著（P<0.01）,ITF组TNF-α较LPS组明显降低,差异非常显著（P<0.01）。肠组织IL-4,IL-10在LPS组较NS组显著增高,差异非常显著（P<0.01）,ITF组IL-4,IL-10较LPS组、NS组均明显降低,差异非常显著（P<0.01）。结论1、LPS可引起幼鼠肠组织损伤,光镜和电镜均有不同程度的改变。Gln和rITF可减轻病理变化,对肠组织损伤有保护作用。2、在内毒素血症早期肠组织TNF-α,IL-4,IL-10均明显增高。随LPS作用的时间延长,TNF-α下降,IL-4,IL-10再次增高,呈双峰现象,这可能有利于抑制炎症反应,减轻炎症介质对肠粘膜的损伤。3、在正常肠组织中,TLR2与NF-кB mRNA和蛋白有较弱的表达,TLR4mRNA和蛋白有稍强的表达。LPS可使肠组织TLR2 mRNA和蛋白明显上调,并随着LPS作用时间的延长,TLR2上调更加明显。在LPS作用早期TLR4与NF-кBmRNA和蛋白表达明显上调,随之下降,并随LPS作用的时间延长,再次增高,呈双峰现象,同抑炎因子IL-4,IL-10的分泌吻合,TLR4可能有促进IL-4,IL-10分泌的作用。在内毒素血症TLR2、4和NF-кB的表达上调可介导LPS对肠组织的损伤。4、Gln通过下调内毒素血症肠组织TLR2、4和NF-кB mRNA及蛋白表达,降低了TNF-α分泌,明显减轻了肠组织的损伤。5、rITF通过抑制内毒素血症肠组织TLR4和NF-кB mRNA及蛋白表达,降低了TNF-α分泌,减轻了LPS对肠组织的损伤。6、TLR2、4与NF-кB蛋白表达在正常对照组和LPS组与TLR2、4与NF-кBmRNA表达相一致。