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研究背景绝大部分心跳骤停(Cardiac Arrest,CA)患者预后极差,美国出院存活率不足8%,而中国仅为1%。复苏后心功能障碍(Post-resuscitation Myocardial Dysfunction,PRMD)与复苏后早期死亡密切相关,但尚缺乏有效的治疗手段。尽管有研究支持PRMD患者接受β受体阻滞剂治疗可改善预后,但因其作用可能造成PRMD加重。因此寻找更安全有效的药物替代β受体阻滞剂迫在眉睫。前期研究显示伊伐布雷定(Ivabradine,IVA)在猪CPR模型中有心肌保护作用,可通过抗氧化应激保护线粒体功能等多种途径去改善心功能,然而IVA对缺血再灌注后心肌尤其是心肌细胞的影响及调控机制尚未报道。因此,本研究以体外缺血缺氧诱导心肌细胞损伤模型为基础,观察IVA对缺血再灌注后心肌细胞的保护作用,以线粒体功能紊乱和氧化应激功能异常为切入点,探讨AMPK/SIRT1/PGC-1α途径IVA对缺血再灌注后心肌能量代谢的调节及作用机制。研究目的通过心肌细胞体外研究,探讨IVA对缺血再灌注损伤后心肌的保护作用及是否与AMPK/SIRT1/PGC-1α途径相关。研究方法本实验是以H9c2大鼠心肌细胞作为研究对象,使用心肌细胞缺血再灌注损伤模型,将H9c2细胞分为4组:(1)对照组(Control);(2)缺血再灌注损伤组(IRI);(3)缺血再灌注损伤+低剂量IVA组(20μM);(4)缺血再灌注损伤+高剂量IVA组(100μM)。首先使用生物能量代谢仪探讨缺血再灌注模型的生物能量代谢特征。然后用CCK-8细胞活力检测法检测细胞活力,筛选出低、高两个浓度以及最佳的作用时间;凋亡检测评估各组凋亡细胞数证明IVA的保护作用;透射电镜观察H9c2细胞线粒体的超微结构,评估IVA对于H9c2细胞线粒体结构的改善作用;荧光探针法检测细胞内ROS含量,评估H9c2细胞内有氧应激程度;HPLC方法测量心肌细胞内ATP、AMP、ADP以及NAD+的含量,评估心肌细胞内氧化还原和能量代谢的变化情况;RT-PCR和蛋白印迹法分别检测H9c2细胞AMPK、SIRT1及PGC-1α基因和蛋白的表达,为初步探讨IVA对IRI心肌细胞保护调控机制打下基础。研究结果1.缺血再灌注后心肌细胞的生物能量学特征:海马结果显示细胞最适种板浓度2万/孔以及最适FCCP浓度为2μM。同时,线粒体应激实验结果显示H9c2心肌细胞在进行IRI模型之后,氧化磷酸化以及糖酵解的能量学指标均发生了变化。与正常组比较,氧化磷酸化指标中基础氧耗值有所下降(P<0.05)以及ATP耗氧量明显下降(P<0.01),而质子漏明显上升(P<0.01)。至于糖酵解指标,与正常组相比,糖酵解明显下降(P<0.01),而糖酵解能力以及糖酵解保留均有所上升(P<0.05)。2.IVA对缺血再灌注损伤后H9c2心肌细胞的影响:CCK-8结果表明随着缺血缺氧时间的延长,细胞活力会逐渐降低。与缺血再灌注损伤组比较,伊伐布雷定(20μM,100μM)预处理12h的时候,细胞活力均有显著提高(P<0.01)。为了进一步探索缺血再灌注模型和IVA对心肌细胞的影响,实验结果显示,与对照组相比,缺血再灌注损伤组细胞凋亡明显上升(P<0.01),ROS含量有所增加(P<0.01)。与缺血再灌注损伤组相比,IVA组细胞凋亡明显降低,ROS含量呈下降趋势。3.IVA对线粒体结构的影响:电镜结果显示与对照组相比,缺血再灌注损伤组的心肌细胞线粒体结构发生严重破坏,有很多空泡状结构出现,线粒体本身从椭圆变成圆形,并伴有肿胀、基质变深的一些特征。IVA组在一定范围内改善了缺氧再灌注所诱导的线粒体得结构破坏,且高浓度IVA的改善效果更明显。4.IVA对缺血再灌注损伤诱导的H9c2心肌细胞在能量代谢以及氧化还原上的影响:与对照组相比,模型组中ATP以及NAD+含量明显降低(P<0.01),AMP和ADP的含量明显上升(P<0.01)。经IVA处理后,细胞内ATP以及NAD+含量都有所增加,AMP和ADP的含量明显减少。5.IVA对缺血再灌注损伤诱导的H9c2心肌细胞在AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路相关基因及蛋白表达的影响:RT-PCR结果显示与对照组相比,模型组AMPK的基因表达几乎没有变化(P>0.05),SIRT1以及PGC-1α的基因表达均有所下降(P<0.05),IVA组明显增加模型组心肌细胞里SIRT1以及PGC-1α的基因表达。在蛋白表达层面,模型组p-AMPKα表达上升(P<0.01),而SIRT1以及PGC-1α的蛋白表达有不同程度下降。IVA组p-AMPKα水平进一步增加,SIRT1以及PGC-1α蛋白的表达也明显增多。研究结论1.心肌细胞缺血再灌注后会出现生物能量代谢紊乱,在氧化磷酸化以及糖酵解两方面均有一定的改变。2.基于AMPK/SIRT1/PGC-1α途径研究IVA对缺血再灌注后心肌能量代谢和氧化应激作用机制,结果表明IVA通过改善缺血再灌注损伤后心肌细胞的线粒体结构,调节能量代谢,减轻氧化应激,提高细胞活力减少凋亡从而保护心肌细胞。3.IVA可以增加缺血再灌注损伤后心肌细胞p-AMPKα和PGC-1α能量通路相关的基因和蛋白表达,改善心肌细胞线粒体的超微结构,增加线粒体ATP以及减少ADP和AMP表达,表明IVA具有调节能量代谢的作用。4.IVA可增加缺血再灌注损伤后心肌细胞SIRT1以及PGC-1α相关线粒体氧化功能基因和蛋白的表达,降低ROS水平,增加细胞内NAD+水平,表明IVA具有调节氧化应激的作用。本实验研究结果表明AMPK/SIRT1/PGC-1α途径是IVA保护线粒体结构、调节能量代谢减轻氧化应激的重要途径,在PRMD的保护中发挥了重要作用。