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种子是种质资源保存的重要载体,对延续物种起着重要作用,但种子自成熟后,会发生活力逐渐下降的不可逆过程,我们称之为种子老化。本实验室前期研究发现种子老化过程中存在活性氧(reactive oxygen species,ROS)介导的线粒体途径的细胞程序化死亡(Programmed cell death,PCD),但具体机制尚不清楚。有文献表明线粒体外膜电压依赖性阴离子通道蛋白(voltage-dependent anionchannel,VDAC)是线粒体途径的PCD中不可缺少的元件,对细胞死亡进程的引发起关键作用。本研究以家榆(Ulmus pumila L.)种子为实验材料,对VDAC在种子老化过程中的作用及其机制开展研究。主要研究内容和结果如下:1.家榆种子老化过程中,伴随ROS爆发,线粒体形态功能均发生变化。ROS供体和抑制剂预处理种子活力检测结果表明,ROS的积累与种子活力的降低之间具有紧密的联系。线粒体特异性荧光探针标记检测发现线粒体在衰老早期的聚集与ROS的产生有关。利用蛋白双向电泳对老化过程中家榆种子线粒体蛋白组进行分析,质谱鉴定发现有37种蛋白,伴随着ROS的爆发和线粒体的聚集,丰度发生改变。大量与TCA循环、蛋白质代谢及抗氧化相关的蛋白伴随老化过程显著下调。进一步发现这些蛋白中有16个其丰度变化响应于ROS,其中包括VDAC。蛋白羰基化修饰组学鉴定出包括VDAC在内的13种蛋白,羰基化修饰程度随老化增加。体外实验证明羰基化修饰引起VDAC通道功能改变,生化检测显示,VDAC的上调表达及羰基化修饰伴随着线粒体细胞色素c(Cytochrome c,Cytc)释放。综上所述,我们推测ROS引发的VDAC功能变化可能是ROS介导的线粒体途径PCD的中间环节。2.家榆种子药理学处理及转基因拟南芥种子老化实验表明VDAC3在老化导致的种子细胞死亡过程中起关键作用。利用GST pull down等实验,筛选到种子老化过程中与UpVDAC3互作蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)。进一步利用免疫共沉淀(Co-IP)及邻近连接技术(Duolink PLA)对不同老化阶段的家榆种子中VDAC与GAPDH的互作情况进行了分析,发现VDAC与GAPDH互作程度在种子老化后增加,并在老化2天时呈现峰值。Dot blotting互作分析表明,UpGAPDH1的谷胱甘肽化修饰促进其与UpVDAC3的相互作用,且免疫印迹及PLA检测显示,老化后GAPDH谷胱甘肽化修饰水平升高,并同样在2天时呈现峰值。为进一步探究二者互作的功能,对UpGAPDH1的谷胱甘肽化修饰位点进行了分析。结合氨基酸定点突变的生化分析和转基因实验表明谷胱甘肽化修饰的UpGAPDH1与UpVDAC3互作可引起线粒体Cytc释放,进而引起细胞死亡。而导致UpGAPDH1谷胱甘肽化修饰的原因可能是自由金属升高引起的GSH及ROS水平的升高。这些结果表明自由金属参与的谷胱甘肽化修饰介导的GAPDH-VDAC互作可能参与VDAC的门控调节。3.研究表明金属结合蛋白更易发生羰基化。利用IMAC金属亲和层析对家榆种子线粒体金属结合蛋白进行捕捉,并与家榆种子老化过程羰基化修饰加重的蛋白进行比对,发现金属结合蛋白是线粒体蛋白羰基化修饰的主要靶点,并且VDAC具有Fe、Cu、Zn三种金属结合能力。生化分析表明,第204位和219位His残基突变的UpVDAC3失去金属结合能力,同时表现出对金属引发的羰基化修饰不敏感。为验证VDAC羰基化修饰对老化过程细胞死亡的作用,分别在酵母和拟南芥中过表达正常型及金属结合位点突变型UpVDAC3,并进行氧化胁迫或种子老化处理,结果表明金属结合位点的突变可缓解UpVDAC3过表达对细胞死亡及种子老化的促进作用。此外,UpGAPDH1与UpVDAC3互作可使后者对金属引发的羰基化修饰更敏感,表明VDAC的羰基化修饰可能也参与VDAC的门控调节。这些研究表明,在家榆种子老化过程中,ROS可能通过蛋白翻译后氧化修饰引起VDAC与其他蛋白互作,或自身发生氧化修饰,来调控VDAC通道活性,从而引起线粒体中凋亡因子的释放。