【摘 要】
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差异显示法是分离未知表达基因的一种有效方法。该方法自问世以来,已得到广泛应用。本研究以愈伤组织培养脱花叶病毒的果蔗Badila(Saccharum officinarum)与未脱毒的果蔗Badil
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差异显示法是分离未知表达基因的一种有效方法。该方法自问世以来,已得到广泛应用。本研究以愈伤组织培养脱花叶病毒的果蔗Badila(Saccharum officinarum)与未脱毒的果蔗Badila为实验材料,利用差异显示方法对其基因表达上的差异进行了研究,以期了解果蔗花叶病的发病机理。 差异显示法要求实验材料有相似的遗传背景,本研究的实验材料满足此要求。为了检测所用实验材料的带毒情况,本研究以甘蔗花叶病毒(SCMV)3’末端序列设计了一对随机引物,对实验材料的带毒情况进行PCR检测。结果表明脱毒果蔗未出现任何PCR条带,未脱毒果蔗出现一条约200bp的PCR条带。说明脱毒果蔗不带花叶病毒,未脱毒果蔗带花叶病毒,遗传背景除了带毒和未带毒这种差异外,其余基本上没有差异,因此此材料适合用于差异显示分析。 差异显示方法要求总RNA的质量较高。本研究建立了一套提取甘蔗叶片总RNA的方法体系,用异硫酸氰胍法和Trizol试剂盒法提取,结果表明这两种方法提取的RNA质量较好,可满足差异显示分析,但两种方法各有利弊。 另外,本研究还建立了一套较成熟的荧光标记的差异显示的操作方法,并用这种方法及筛选出的23对引物对实验材料进行DDRT-PCR,PCR产物在序列胶上电泳后进行扫描出带,从序列胶上挑选出9条差异明显的条带,大小均在250~350bp之间。这9条差异条带中其中5条是强弱的差异,4条是有无的差异;5条来自脱毒果蔗,4条来自未脱毒果蔗。这9条差异条带经过二次扩增证明大小与序列胶上相一致。
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